鄰苯二甲酸二異壬酯致小鼠肝組織氧化損傷的研究

陸 杰，代園園，羅 慧，龔金鋒，王緒楊，武 陽，，楊 旭，馬 萍，*（.湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 43700；.華中師范大學生命科學學院環(huán)境生物醫(yī)學實驗室，湖北 武漢 430079）

鄰苯二甲酸二異壬酯致小鼠肝組織氧化損傷的研究

陸 杰1，代園園1，羅 慧1，龔金鋒1，王緒楊1，武 陽1，2，楊 旭2，馬 萍1，2*（1.湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100；2.華中師范大學生命科學學院環(huán)境生物醫(yī)學實驗室，湖北 武漢 430079）

研究鄰苯二甲酸二異壬酯對小鼠肝細胞的氧化損傷.以昆明小鼠為受試動物，隨機分為5組，包括1個陰性對照組、4個鄰苯二甲酸二異壬酯染毒組，染毒組按0.5，5，50，500mg/kg4個劑量水平，灌胃染毒小鼠14d.以肝組織勻漿測定活性氧（ROS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量；以肝組織細胞測定DNA-蛋白質交聯(lián)（DPC）系數(shù).隨著鄰苯二甲酸二異壬酯染毒劑量的升高，肝組織的ROS、MDA、8-OHdG含量和DPC系數(shù)逐漸上升，GSH含量逐漸降低，各指標呈一定的劑量-效應關系.染毒劑量為50mg/kg時， ROS、GSH、8-OHdG含量和DPC系數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05， P＜ 0.01）；染毒劑量為500mg/kg時，上述指標差異均有統(tǒng)計學（P＜ 0.05，P＜ 0.01）.同時對小鼠肝組織形態(tài)進行光鏡觀察，結果表明，隨著染毒劑量的加大，小鼠肝細胞的病理損傷越嚴重.較高劑量（≥50mg/kg）的鄰苯二甲酸二異壬酯能造成小鼠肝組織的氧化損傷.

活性氧；還原型谷胱甘肽；丙二醛；8-羥基脫氧鳥苷；DNA-蛋白質交聯(lián)；氧化損傷

鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）屬于鄰苯二甲酸酯類化合物，是一種新型替代增塑劑，現(xiàn)廣泛應用于各類軟質聚氯乙烯產(chǎn)品、橡膠產(chǎn)品和涂料的工業(yè)生產(chǎn)中.作為鄰苯二甲酸酯類物質中重要的類型，DINP可以通過皮膚接觸、進食、飲水和空氣吸入等多種途徑進入人體［1-2］，對于DINP毒性的研究已經(jīng)受到環(huán)境科學學者們的廣泛關注.Boberg等［3］研究發(fā)現(xiàn)DINP的劑量高于300mg/（kg·d）時對Wistar大鼠有抗雄性激素作用，具有生殖毒性.Kaufmann等［4］研究了DINP的致癌性，發(fā)現(xiàn)DINP在大鼠體內能誘導過氧化物酶的生成，進而誘導肝腫瘤的產(chǎn)生.Saillenfait等［5］對Sprague-Dawley大鼠進行DINP的口服染毒實驗，發(fā)現(xiàn)DINP能導致其胚胎發(fā)育毒性和產(chǎn)后畸形.2005年，歐盟規(guī)定兒童可放進口中的玩具及兒童護理用品，其塑料所含的3類鄰苯二甲酸鹽（DINP、DIDP及DNOP），濃度不得超過0.1%［6］.有關鄰苯二甲酸酯類物質的毒理學研究己有諸多報道，但有關DINP的毒性機理研究相對較少，國內未見相關報道.DINP在嚙齒類動物和人體內的吸收、分布、代謝和排泄已經(jīng)得到闡明［7］，但國內外有關DINP氧化損傷的研究并不多見，大都是以研究人的體液（如尿液，乳汁，唾液，血清等）的氧化代謝物為主［8-9］.本研究以SPF級雄性昆明小鼠為實驗材料，采用DINP體內染毒方法，通過檢測其肝組織勻漿測定活性氧、還原型谷胱甘肽、丙二醛、8-羥基脫氧鳥苷的含量，并以肝組織細胞測定DNA-蛋白質交聯(lián)系數(shù)的變化以及通過肝組織切片觀察，探討DINP對小鼠肝細胞氧化損傷的機制，為全面探討DINP的毒性效應及分子機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑 Power wave XS酶標儀（美國Bio-Tek儀器有限公司），F(xiàn)Lx 800熒光酶標儀（美國Bio-Tek儀器有限公司），F(xiàn)-4500型熒光分光光度計（日本日立公司），5415R低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司），RM2245切片機（德國LEICA公司），HH-42三用電熱恒溫水箱（長源實驗儀器廠，北京）；DCFH-DA熒光染料（＞99.9%，Sigma公司），蛋白酶K（Sigma公司），小鼠8-羥基脫氧鳥苷ELISA檢測試劑盒（濟南朋遠生物技術有限公司，濟南），還原型谷胱甘肽試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京），Hoechst33258熒光染料（Sigma公司），三羥基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCL，分析純，Amresco分裝）， 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），硫代巴比妥酸（TBA，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP，≥99.6%，Sigma公司）.

1.1.2 實驗動物 選用湖北省實驗動物研究中心提供的SPF級雄性昆明小鼠30只（合格證號:No. 42000600001226），體重為（33.15±1.15）g，飼養(yǎng)1周后實驗，實驗動物使用許可證號:SYXK（鄂）2013-0071.實驗過程中，小鼠飼養(yǎng)于無菌籠內，保持溫度在20～25℃內，籠內相對濕度為50%～70%，以商業(yè)鼠糧飼養(yǎng)小鼠，及時補充飲用水，并避免其接觸其它干擾致病源，小鼠可自由進食進水.

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和染毒 國際所規(guī)范的DINP可接受的日攝入量（ADI）上限在0.02～0.14mg/kg之間.在ADI水平的基礎上，Lington等［10］研究表明，DINP的未觀察到有害效應的水平（NOAEL）為15mg/kg，而Moore［11］的研究表明DINP的NOAEL可達88mg/kg.因此，考慮到DINP劑量的不確定性，模擬評估DINP最大的風險劑量，并參照Gray等［12］和McKee等［13］文中提及的500mg/kg作為本實驗最高的染毒劑量， 0.5mg/kg作為本實驗最低的染毒劑量.

30只昆明小鼠隨機分為5組，包括1個陰性對照組、4個DINP染毒組，每組6只.染毒組的染毒劑量分別為0.5，5，50，500mg/kg，以生理鹽水稀釋成0.05，0.5，5，50mg/mL4種濃度的使用液，稀釋過程中加與DINP等量的吐溫80助溶；因吐溫80只是作為DINP的助溶劑，量很小，對生物體無毒無副作用，所以陰性對照組只是給予生理鹽水.稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用時在旋渦混懸儀上充分混勻.均經(jīng)口灌胃給予，灌胃量為10mL/kg，每天1次，連續(xù)染毒14d，分別于實驗前稱小鼠體重.

1.2.2 肝組織切片的制備和觀察 染毒結束后用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取肝組織，肝組織用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟切片，HE染色，普通光學顯微鏡下觀察肝組織的病理組織學變化.

1.2.3 肝組織勻漿和懸液的制備 將肝組織在冰冷的PBS（pH7.5）中漂洗，濾紙拭干，分成2部分，一部分肝組織加PBS制成10%勻漿液，低溫離心后取上清，用于ROS、GSH、MDA和8-OHdG的檢測.另一部分肝組織剪成糜狀，過濾后將濾液離心去上清，再用 PBS重懸細胞，用于DPC系數(shù)的檢測.

1.2.4 ROS含量的測定 取上清液4μL，加入396μL PBS作100倍稀釋.取100μL稀釋液于酶標板中排列，并加入100μL熒光染料DCFA染色，避光反應5min，用熒光酶標儀檢測.

1.2.5 蛋白質含量和GSH含量的測定 蛋白質含量按照Folin酚法測定，GSH含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行.GSH含量（μmol/ gprot）=［（測定OD值-空白OD值）/（標準OD值-空白OD值）］×標準管濃度×樣本稀釋倍數(shù)÷待測勻漿蛋白濃度（gprot/L）.

1.2.6 MDA含量的測定 取500μL上清液于試管中，并加入2mL0.6%TBA，沸水浴15min.取上清1mL于EP管中，10000×g離心5min.取上清100μL于酶標板中排列，用全波長酶標儀檢測，分別在450，532，600nm波長下測定吸光值（以加PBS的為參照），按照公式計算MDA濃度（μmol/ L）=6.45（A532-A600）-0.56A450，式中:A為吸光度.

1.2.7 8-OHdG含量的測定 8-OHdG含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行.以0，3，6，12，24，48ng/mL等標準品濃度為橫坐標，450nm處OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線來確定樣品中8-OHdG的含量.

1.2.8 DPC系數(shù)的測定 DPC采用KCl-SDS沉淀法進行檢測［14］.首先向樣品中加入SDS，使之與DPC及蛋白質結合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白質沉淀，而游離的DNA留在上清液中.將上清液轉移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質，使DPC中的DNA游離出來，用熒光法測定此DNA的含量A（交聯(lián)DNA）以及原液中DNA的含量B（游離DNA），計算DPC系數(shù)η［η= A/（A+B）］.

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 小鼠體重和肝組織的臟器系數(shù)

小鼠體重和肝組織的臟器系數(shù)見表1，與對照組比較，各劑量組小鼠體重和臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）.

表1 DINP染毒小鼠的體重和臟器系數(shù)（n=6，± s）

表1 DINP染毒小鼠的體重和臟器系數(shù)（n=6，± s）

組別 染毒前 染毒后 臟器系數(shù)對照組 33.77±0.563 35.25±0.655 0.053±0.001 0.5mg/kg DINP 35.91±0.683 37.38±0.791 0.054±0.002 5mg/kg DINP 34.21±0.631 36.81±0.538 0.052±0.001 50mg/kg DINP 34.43±0.831 35.61±1.385 0.052±0.002 500mg/kg DINP 34.83±0.839 35.11±1.453 0.051±0.003

2.2 小鼠肝組織形態(tài)的光鏡觀察結果

從圖1可看出，空白對照組肝組織結構及細胞形態(tài)正常，中央靜脈及周圍放射狀肝細胞索清晰，肝索和肝竇比例正常.0.5mg/kg劑量組肝小葉結構完整，肝索和肝竇比例較正常.5mg/kg劑量組肝竇變窄，肝索增寬；肝細胞輕度水腫，體積增大、胞漿疏松化.50mg/kg劑量組肝小葉結構有所紊亂，肝竇寬窄不一，肝索擁擠、扭曲、變形；肝細胞損傷明顯，可見病理性核分裂像.500mg/kg劑量組肝小葉結構紊亂；肝索、肝竇結構不清；肝細胞結構破壞，壞死明顯.結果表明，隨著染毒劑量的加大，小鼠肝細胞的病理損傷越嚴重.

圖1 不同DINP處理組肝組織切片圖（10×40， HE染色）Fig.1 Liver slices of different DINP groups （10×40， HE dyed）

2.3 小鼠肝組織ROS含量的變化

ROS含量是反映機體氧化應激水平的指標，由圖2可以看出，隨著染毒劑量的升高，ROS含量逐漸上升，呈一定的劑量-效應關系.與對照組比較，0.5，5mg/kg劑量組差異無統(tǒng)計學意義，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）.較高劑量的DINP能造成ROS含量的上升.

圖2 不同DINP處理組小鼠肝臟ROS含量Fig.2 ROS content in mouse liver of different DINP groups

2.4 小鼠肝組織GSH含量的變化

圖3 不同DINP處理組小鼠肝臟GSH含量Fig.3 GSH content in mouse liver of different DINP groups

GSH是GPx（谷胱甘肽過氧化物酶）催化過氧化物還原的必需底物，可反映機體抗氧化應激的水平，由圖3可以看出，隨著DINP染毒劑量的升高，GSH含量逐漸下降，呈一定的劑量-效應關系.與對照組比較，0.5，5mg/kg劑量組差異無統(tǒng)計學意義，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05， P＜0.01）.在較高劑量的DINP作用下，小鼠肝的GSH含量下降明顯.

2.5 小鼠肝組織MDA含量的變化

由圖4可見，與對照組比較，不同劑量的DINP均能使小鼠肝MDA含量有不同程度的升高.0.5，5，50mg/kg劑量組差異無統(tǒng)計學意義，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），這表明小鼠肝組織的脂膜已受到損傷.

圖4 不同DINP處理組小鼠肝臟MDA含量Fig.4 MDA content in mouse liver of different DINP groups

2.6 小鼠肝組織8-OHdG含量的變化

圖5 不同DINP處理組小鼠肝臟8-OHdG含量Fig.5 8-OHdG content in mouse liver of different DINP groups

由圖5可見， 與對照組比較，不同劑量的DINP能使小鼠肝8-OHdG含量有不同程度的升高.0.5，5mg/kg劑量組差異無統(tǒng)計學意義，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05， P＜0.01），在較高劑量的DINP作用下，小鼠肝臟的8-OHdG含量升高明顯.

2.7 小鼠肝臟DPC系數(shù)的變化

用KCl-SDS沉淀法檢測DPC系數(shù)，如圖6所示，隨著DINP染毒劑量的升高，DPC系數(shù)逐漸上升，呈一定的劑量-效應關系.0.5，5mg/kg劑量組差異無統(tǒng)計學意義，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05， P＜ 0.01）.

圖6 不同DINP處理組小鼠肝臟DPC系數(shù)Fig.6 DPC coefficients in mouse liver of different DINP groups

3 討論

細胞中ROS含量是反映細胞內氧自由基水平的主要指標［15］.ROS在機體正常代謝狀態(tài)下含量很低，在胞內信號轉導的氧化還原調控中起重要作用［16］；但過量活性氧物質（主要是ROS）的產(chǎn)生會破壞細胞內氧化和抗氧化之間的平衡，從而誘導機體產(chǎn)生氧化應激作用，氧化應激是許多疾病的重要發(fā)病機制［17-18］.還原型的GSH可以和ROS結合形成硫代半縮醛，并通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)生成具更強抗氧化作用的抗壞血酸［19］.還原型的GSH是ROS的主要清除劑，它的消耗能反應機體的受氧化損傷程度［20-21］，在評價氧化損傷中具有重要意義.本研究中，隨著DINP染毒劑量的升高，ROS含量逐漸上升，GSH含量逐漸下降.與對照組比較，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）.說明在較高劑量DINP誘導之下小鼠肝組織細胞內產(chǎn)生了過量的ROS，受到ROS攻擊，細胞的抗氧化能力下降.

過量的ROS還可使脂質發(fā)生過氧化反應，改變細胞膜的結構，使膜成分之間形成交聯(lián)和聚合，影響膜受體、膜蛋白酶和離子通道的功能，甚至導致細胞死亡.脂質過氧化反應的主要代謝產(chǎn)物是MDA，其水平的高低代表脂質過氧化的強度［22-23］.在本研究中，500mg/kg劑量組MDA含量與對照組差異有統(tǒng)計學意義（p ＜ 0.01），這表明小鼠肝組織的脂膜已受到損傷.

8-OHdG是活性氧自由基攻擊DNA 分子中的鳥嘌呤第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，它是活性氧基團引起的DNA 氧化損傷修飾產(chǎn)物之一.8-OHdG在體內穩(wěn)定存在，為代謝終產(chǎn)物，且只能通過DNA 氧化損傷途徑形成，是目前國際上公認的一種新型評價DNA氧化損傷和氧化應激狀態(tài)敏感的生物標志物，測定機體8-OHdG含量對評估體內氧化損傷和修復程度有重要意義［24-25］.ROS對細胞的氧化損傷作用還會引起DNA-蛋白質交聯(lián)，DNA-蛋白質交聯(lián)難以修復，對參與DNA復制、轉錄和修復的蛋白質活動起阻礙作用，增加了染色體畸變和姊妹染色單體交換［26］.本研究中，不同劑量的DINP能使小鼠肝8-OHdG含量和DPC系數(shù)有不同程度的升高，與對照組比較，50，500mg/kg劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05， P＜0.01），說明較高劑量的DINP能使小鼠肝8-OHdG的形成以及DNA和蛋白質交聯(lián)的增多，造成肝組織的DNA損傷.

4 結論

4.1 通過對肝組織進行病理學觀察發(fā)現(xiàn)，隨著DINP染毒劑量的升高，小鼠肝細胞的病理損傷越嚴重.染毒劑量為50mg/kg時，肝小葉結構有所紊亂，肝竇寬窄不一，肝索扭曲和變形；肝細胞損傷明顯，可見病理性核分裂像.染毒劑量為500mg/kg時，肝小葉結構紊亂；肝索、肝竇結構不清；肝細胞結構破壞，壞死明顯.

4.2 在較高劑量DINP誘導之下小鼠肝組織細胞內產(chǎn)生了過量的ROS，破壞了自身的氧化與抗氧化平衡，使細胞的抗氧化能力下降，間接引起了小鼠肝組織的脂質過氧化反應和8-OHdG的形成，以及DNA和蛋白質交聯(lián)的增多，造成肝組織的氧化損傷和病理損傷.

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Oxidative damage of mouse liver tissue induced by diisononyl phthalate.

LU Jie1， DAI Yuan-yuan1， LUO Hui1，GONG Jin-feng1， WANG Xu-yang1， WU Yang1，2， YANG Xu2， MA Ping1，2*（1.College of Basic Medical， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100，China；2.Laboratory of Environment Biomedicine， School of Life Science，Central China Normal University， Wuhan 430079， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：285～290

To investigate the oxidative damages of diisononyl phthalate on mouse liver cells， Kunming mice were randomly grouped into five groups and orally administered with drugs daily for fourteen days； the groups included one solvent control group， four diisononyl phthalate groups. The exposure doses of diisononyl phthalate groups were 0.5， 5， 50 and 500mg/kg respectively. Some liver tissues were then made into homogenates for the measurement of ROS （reactive oxygen species），GSH （glutathione）， 8-hydroxy-2-deoxyguanosine （8-OHdG） and MDA （Malondialdehyde） contents. Meanwhile， DPC（DNA-protein Crosslink） coefficients were detected from liver cell suspension. The liver contents of ROS， MDA， 8-OHdG and DPC coefficients increased gradually in a dose-dependent manner， whereas GSH content decreased accordingly. In the exposure group with the dose of 50mg/kg， ROS， GSH， 8-OHdG contents and DPC coefficients were significantly higher than those of the control group （P＜0.05， P＜ 0.01）； There were significant differences in levels of each biomarker between 500mg/kg group and control group （P＜ 0.05，P＜ 0.01）. Meanwhile liver tissues were sliced for physiological observation，the results showed that tissue injury were severed gradually with the increase of exposure concentration. diisononyl phthalate at certain doses （≥50mg/kg） can induce oxidative stress in mice liver.

reactive oxygen species；glutathione；malondialdehyde；8-hydroxy-2-deoxyguanosine；DNA-protein crosslinks；oxidative stress

X503.22

A

1000-6923（2015）01-0285-06

陸 杰（1992-），男，湖北咸寧人，湖北科技學院本科生，主要從事環(huán)境毒理學研究.

2014-04-07

湖北省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201310927010）；湖北省自然科學基金項目（2014CFB284）；國家自然科學基金重點項目（51136002）

* 責任作者， 教授， mping68@126.com