鄢又玉，沈丹華，王紅娟，吳平，趙春芳，余龍江，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

火棘原花青素制備及抗氧化功效研究

鄢又玉1，2，沈丹華2，王紅娟2，吳平2，趙春芳1，余龍江1，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

以原花青素為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化了火棘果原花青素的提取工藝。結(jié)果表明：提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)和酸醇比對(duì)原花青素提取制備影響顯著，火棘果原花青素最佳制備工藝為：提取時(shí)間80 min，料液比1∶10（W∶V，g/mL），提取溫度90℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)66%，酸醇比1∶50，提取次數(shù)為2次，依照此工藝，原花青素提取率為18.32%，與理論響應(yīng)值18.55%基本吻合。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了火棘果原花青素與抗氧化能力的相關(guān)性，結(jié)果表明火棘果原花青素對(duì)其抗氧化功效貢獻(xiàn)顯著。

火棘果；原花青素；響應(yīng)面優(yōu)化；抗氧化

火棘（Pyracantha fortuneana（Maxim）Li.）又名赤陽子、紅子、火把果、救軍糧等，是薔薇科蘋果亞科火棘屬常綠野生灌木，廣泛分布于我國東南和西南各省的廣大地區(qū)［1］，我國共有16個(gè)省盛產(chǎn)火棘，如貴州省火棘鮮果年產(chǎn)量在2 500萬千克以上［2］，湖北省鄂西南及神農(nóng)架年均產(chǎn)果近1億千克［3］，資源極為豐富。

火棘果為藥食同源植物，含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)［3-4］。近年來對(duì)火棘果中維生素、多糖、黃酮類及微量元素等研究較多［5-6］，而對(duì)其中原花青素提取及相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。原花青素（Proanthoyanidins）是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成的黃烷3-醇衍生物的總稱，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑［7］，具有非常強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性［7］?？蓮V泛應(yīng)用于改善血液循環(huán)、降血壓、降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抗輻射、抗腫瘤、預(yù)防白內(nèi)障、滋潤及美白皮膚等［8-10］，火棘果原花青素的開發(fā)極具市場(chǎng)前景。

響應(yīng)面法是采用多元二次回歸法作為函數(shù)估計(jì)的工具，結(jié)合數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)建立曲面模型［11］，通過對(duì)回歸方程的分析找出最優(yōu)工藝，在工程應(yīng)用中可縮減工作量并提高準(zhǔn)確性［12-13］。目前已廣泛用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域?，F(xiàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Box-Benhnken（BBD）設(shè)計(jì)對(duì)火棘果原花青素提取制備進(jìn)行優(yōu)化，得出火棘果原花青素最佳制備工藝，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察其與抗氧化功效的相關(guān)性，以此為火棘果未來的精深開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：火棘果于2012年11月中旬采摘湖北恩施來鳳地區(qū)，干燥粉碎后過20目篩備用。

試劑：實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，香草醛、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸均為分析純，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海金穗生物科技有限公司，總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

UV-5100型紫外可見光分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；Centrifuge 5424R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Elmendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以無水乙醇配制兒茶素母液1 mg/mL。分別稀釋成濃度梯度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液，依照“0.5 mL樣品+3 mL 4%香草醛甲醇溶液+1.5 mL濃鹽酸”反應(yīng)體系，搖勻，30℃下反應(yīng)20 min，于500 nm處測(cè)定吸光度［14］，以濃度（C）與吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=2.087 2C+0.045 1（R2= 0.999 8），表明在兒茶素濃度0.05 mg/mL～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

1.3.2 火棘果原花青素最佳提取條件的確定

分別考察乙醇濃度，料液比，加酸量，提取時(shí)間、溫度及提取次數(shù)等因素對(duì)原花青素提取的影響，并從中擬選影響顯著的3個(gè)因素：乙醇濃度、提取溫度、鹽酸體積，應(yīng)用Design-Expert Software8.0.6軟件，進(jìn)行BBD設(shè)計(jì)，以期確定火棘果原花青素的最優(yōu)提取工藝。

1.3.3 火棘果原花青素含量計(jì)算

將測(cè)定出的吸光度值按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=

式中：C為提取液濃度，（mg/mL）；n為提取液測(cè)試前總稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；m為秤取的火棘果皮渣質(zhì)量，g。

1.3.4 提取物總抗氧化能力測(cè)定

測(cè)定方法：取一定量提取液高速冷凍離心，用pH 6.86的緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)，參照總抗氧化能力（T—AOC）試劑盒操作說明書操作，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

單位定義：在37℃時(shí)，每分鐘每克火棘果皮肉粉提取后的提取液使反應(yīng)體系的吸光度（OD）每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位，單位為unit/g。 2.087 2 C+0.045 1（R2=0.999 8）換算成濃度值，按下面公式計(jì)算出提取物中原花青素含量

式中：ODu為測(cè)定管吸光度；ODc為對(duì)照管吸光度；k為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（=反應(yīng)液總體積/取樣量）；n樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積，mL；m為提取的火棘果皮渣粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果分析

2.1 6種單因素對(duì)火棘果原花青素提取率的影響

稱取火棘果皮渣粉20 g，以乙醇為提取溶劑，一定料液比及提取溫度，回流提取一定時(shí)間后，趁熱過濾，冷卻后乙醇定容至一定體積，適當(dāng)稀釋后按1.3.1中操作，測(cè)吸光度值。分別依次考察了提取時(shí)間，提取溫度，乙醇濃度，料液比，鹽酸加入量及提取次數(shù)對(duì)原花青素提取得率的影響，結(jié)果分別見圖1～圖6。

圖1 提取時(shí)間對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.1 Effect of time on yield of proanthocyanidins

圖2 提取溫度對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of proanthocyanidins

圖3 乙醇濃度對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of proanthocyanidins

圖4 料液比對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on yield of proanthocyanidins

圖5 濃鹽酸的量對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

圖6 提取次數(shù)對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of extraction frequency on yield of proanthocyanidins

由圖1可知：隨著提取時(shí)間的延長，提取液中原花青素溶出量最初快速增加，至80 min后增幅減小，并且，隨加熱提取時(shí)間延長，有可能導(dǎo)致溶出的原花青素降解而影響其活性，綜合考慮能耗及提取效率，提取時(shí)間選為80 min較適。

由圖2可知：隨著提取溫度的逐步升高，提取液中原花青素的濃度逐步增加。當(dāng)溫度上升至90℃左右時(shí)，隨著溫度進(jìn)一步上升，原花青素濃度增加不明顯，甚至略有下降趨勢(shì)。由此說明隨著溫度升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度加快，從而使其滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快；另一方面，高溫也使細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，有利于原花青素從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到提取溶劑中。但是，溫度過高也同時(shí)加快了溶出原花青素的氧化分解，從而使原花青素濃度下降。綜合考慮能耗及經(jīng)濟(jì)成本等因素，提取溫度選為90℃時(shí)較合適。

由圖3可知：隨著乙醇濃度的增加，提取液中原花青素的濃度先逐漸增大，然后逐步減小，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%左右時(shí)，原花青素提取率相對(duì)最高，這表明此時(shí)原花青素溶出量達(dá)到最大，此后隨著乙醇濃度進(jìn)一步增加，醇溶性雜質(zhì)及疏水性強(qiáng)的成分溶出量相對(duì)增加，原花青素溶出量相對(duì)減少，因此，提取所用乙醇的最適濃度選為50%。

由圖4可知：隨著料液比的增加，原花青素溶出量（以同一容積中原花青素濃度表示）先快速增加，隨后增幅減緩。這表明，提取溶劑量大時(shí)，火棘果皮渣細(xì)胞膜在短時(shí)間內(nèi)急劇膨脹破裂，原花青素被迅速萃取進(jìn)入溶劑；而料液比較小時(shí)，一方面無法使原料達(dá)到有效浸泡，另一方面溶劑中的原花青素也極易達(dá)到飽和，從而抑制其進(jìn)一步溶出。當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，原花青素幾乎被最大限度提取出來了。綜合考慮成本及后續(xù)濃縮處理，料液比選取1∶10左右較為合適。

由圖5可知：酸性條件更有利于原花青素的提取，其主要是因?yàn)樗峥梢种品宇愇镔|(zhì)與金屬離子的沉淀反應(yīng)，增強(qiáng)了溶劑破壞結(jié)合鍵的能力，破壞酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖、及自身之間的氫鍵和疏水鍵作用，從而提高原花青素的溶出量。但酸量達(dá)到3 mL后酸的增加量對(duì)原花青素的提取率影響減小甚至使原花青素酸解。因此考慮到后期工業(yè)化生產(chǎn)，酸度過高將導(dǎo)致設(shè)備易腐蝕等，選取加酸量為3 mL左右較合適。

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，原花青素提出量逐漸減少，綜合考慮工作量、生產(chǎn)成本、工作效率及后續(xù)處理等因素，選取提取2次較為合理，能較大程度提取出原花青素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化火棘果原花青素提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取對(duì)火棘果原花青素影響顯著的3個(gè)因素：提取溫度，乙醇濃度，鹽酸加入量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化考察。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis experiment

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案

以乙醇濃度A、提取溫度B、鹽酸體積C為自變量，以火棘果原花青素提取率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果Table 2 The optimization scheme and results of response surface experimental design

2.2.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過RSA軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=17.53+1.52A+0.18B+4.48C+0.73AB+1.19AC-0.77BC-2.22A2-1.58B2-5.91C2，各因素的方差分析見表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Mean square analysis of response surface regression model

表3中，失擬項(xiàng)0.526 7＞0.05不顯著，模型項(xiàng)（Prob＞F）＜0.000 1高度顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2（模型平方和/總差=381.39/386.20=98.75%）較大，表明該模型擬合度好。

從表3還可以看出，影響火棘果原花青素提取率的3個(gè)因素按影響大小排序依次是C（鹽酸體積）＞A（乙醇濃度）＞B（提取溫度），其中鹽酸體積影響極顯著，乙醇濃度為影響顯著因素。進(jìn)一步考察三個(gè)因素中交互作用對(duì)提取率的影響，對(duì)其曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7，圖8及圖9。

圖7 乙醇濃度和提取溫度對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration and extraction temperature on yield of proanthocyanidins

曲面圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，圖7，圖8和圖9表明乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取溫度和鹽酸積與提取液原花青素含量均呈二次方程關(guān)系。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則交互作用不顯著。圖7，圖8，圖9等高線圖表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取溫度，和酸醇比三者之間均有交互作用，交互作用的影響可能導(dǎo)致響應(yīng)面預(yù)測(cè)最佳值與單因素最佳值相對(duì)偏移。

2.3 模型的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

圖8 乙醇濃度和鹽酸體積對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration and hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

圖9 提取時(shí)間和鹽酸體積對(duì)火棘果原花青素提取率的影響Fig.9 Effect of extraction temperature and hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

通過二次回歸方程，軟件分析預(yù)測(cè)得到的各影響因素最佳值為：乙醇濃度65.68%，提取溫度91.98℃，加酸量4.01 mL，料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取時(shí)間80 min，提取2次。此時(shí)火棘果原花青素理論預(yù)估提取率為18.55%。調(diào)整該工藝為：乙醇濃度66%，提取溫度90℃，加酸量4 mL，料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取時(shí)間80 min。同時(shí)提取3組，實(shí)際測(cè)得的平均提取率為18.32%，與理論預(yù)測(cè)值18.55%基本吻合，因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

說明：為更加清楚的反映火棘果原花青素提取工藝參數(shù)，現(xiàn)將加酸量與提取液體積綜合考慮，得最優(yōu)工藝下的酸醇比為1∶50（4 mL/200 mL）。

2.4 火棘果原花青素抗氧化與其最優(yōu)工藝下的總抗氧化能力的對(duì)比

參照本實(shí)驗(yàn)室得到的火棘果抗氧化成分優(yōu)化工藝，用68%的乙醇，按料液比1∶10（W/V∶g/mL），酸醇比1∶25，在90℃下提取60 min，提取2次，合并提取液，定容至200 mL，測(cè)定提取液的總抗氧化能力；根據(jù)本實(shí)驗(yàn)得到的火棘果原花青素優(yōu)化工藝，用66%的乙醇，按料液比1∶10（m/v），酸醇比1∶50，在90℃下提取80 min，提取2次，合并提取液，定容至200 mL，測(cè)定原花青素的抗氧化能力。每組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)提取3次，結(jié)果見表4。

表4 火棘果抗氧化成分的抗氧化能力與原花青素抗氧化能力比較Table 4 Comparison of antioxidant capacity between proanthocyanidins with antioxidant ingredients

從表4數(shù)據(jù)分析得出：火棘果中原花青素所貢獻(xiàn)的抗氧化能力在火棘果抗氧化提取物總抗氧化能力中占了很大比例，火棘果原花青素的提取具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以火棘果原花青素提取率為量化指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化了火棘果原花青素的提取制備工藝。確定了火棘果原花青素最佳提取工藝為乙醇濃度66%，提取溫度90℃，酸醇比1∶50（V/V），料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取時(shí)間80 min，提取2次。在此條件下，原花青素提取率為18.32%，與理論響應(yīng)值18.55%基本吻合。進(jìn)一步考察火棘果原花青素與其抗氧化能力的相關(guān)性，結(jié)果表明火棘果原花青素對(duì)火棘果抗氧化能力貢獻(xiàn)顯著。

［1］王三根，鄧如福.野生植物火棘的開發(fā)利用及生理生態(tài)［J］.中國野生植物資源，1988（3）：13-15

［2］蔡金騰，丁筑紅.貴州省火棘資源調(diào)查研究［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（4）：52-55

［3］王敬勉，廖德勝，粟巧功，等.火棘果營養(yǎng)成份及果膠的研究［J］.食品科學(xué)，1992，13（4）：40-42

［4］曾令貴，鐘露苗.火棘的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用概況［J］.中國藥事，2009，23（10）：1021-1023

［5］黃祖良，韋國鋒，何有成，等.桂西火棘果實(shí)特性和營養(yǎng)成分的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2004，25（2）：75-76

［6］黃永春，楊鋒，段玉峰.火棘水溶性多糖PP-A3理化性質(zhì)研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（8）：75-79

［7］Bagchi D，Garg A，Krohn RL，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro［J］.Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1997，95（2）：179-189

［8］張冰若，勞業(yè)興，蘇薇薇.原花青素的研究現(xiàn)狀及開發(fā)前景［J］.中藥材，2003，26（12）：905-908

［9］ Yamakoshi J，Saito M，Kataoka S，et al.Procyanidin-rich extract from grape seeds prevents cataract formation in hereditary cataractous（ICR/f）rats［J］.J Agric Food Chem，2002，50（17）：4983-4988

［10］Packer L，Rimbach G，Virgili F.Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine（Pinus maritima）bark，pycnogenol［J］.Free Radic Biol Med，1999，27（5/6）：704-724

［11］Schotanus，M I J.Franchin，p.Lupoi，A，et al.Seismic Fragility Analysis of 3D Structures［J］.Structural Safety，2004，26（4）：421-441

［12］Das P K，Zheng Y.Cumulative formation of response surface and its use in reliability analysis［J］.Probabilistic Engineering Mechanics，2000，15（4）：309-315

［13］Guan X L，Melchers R E.Effect of Response Surface Parameter Variation on Structural Reliability Estimates［J］.Structural Safety，2001，23（4）：429-444

［14］李綺麗，吳衛(wèi)國，彭芳剛，等.蓮子皮原花青素測(cè)定方法的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（2）：241-245

Pyracantha Fortuneana Procyanidins Preparation and Their Correlation Research with Antioxidant Activity

YAN You-yu1，2，SHEN Dan-hua2，WANG Hong-juan2，WU Ping2，ZHAO Chun-fang1，YU Long-jiang1，*
（1.School of Life Science&Technology，Huazhong University of Science&Technology，Wuhan 430074，Hubei，China 2.School of Biological&Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Take proanthocyanidins as the evaluation target，on the basis of single factor experiments，the central composite design and response surface analysis are adopted to optimize the extraction technology of proanthocyandins from pyracantha fortuneana fruits.The results show that the extraction temperature，ethanol concentration （V/V）and the ratio of acid to alcohol are factors that affect proanthocyanidins significantly.The optimizing extraction process is：extraction time of 80 min，material-solvent ratio of 1∶10 （W∶V，g/mL），temperature of 90℃，ethanol concentration of 66%，acid-ethanol ratio of 1∶50 and extraction times of 2. Under these conditions the extraction rate of proanthocyanidins is 18.32%and fits well with the predicted value 18.55%.Further，correlations of the proanthocyanidin with the total antioxidant capacity of pyracantha fortuneana are compared，and the results show that pyracantha fortuneana Proanthocyanidins have strong antioxidant activity.

pyracantha fortuneana；proanthocyanidins；optimization of response surface analysis；antioxidant activity.

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.010

2013-12-01

鄢又玉（1975—），女（漢），博士，研究方向：天然藥物。

*通信作者