楊小青，宋金春*，謝順嵐，郝好華

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060；2武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072

隨著中藥在國內(nèi)外市場中所占比例日趨增大，中藥現(xiàn)代化和國際接軌已成客觀現(xiàn)實(shí)，這一發(fā)展使中藥毒理學(xué)的研究愈發(fā)重要?，F(xiàn)代研究表明，蓮子心生物堿具有抗高血壓、抗脂肪形成、抗高血脂、抗肥胖、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用[1-2]。目前對于蓮子心總生物堿的研究主要集中于總生物堿的主成分分析，以及單體藥理作用研究上，但少有針對蓮子心生物堿安全性的系統(tǒng)評價(jià)。本研究通過蓮子心總生物堿的急性毒性和長期毒性試驗(yàn)，以血清生化指標(biāo)檢測及病理切片觀察相結(jié)合，旨在利用客觀、科學(xué)的方法探討蓮子心總生物堿的毒副作用，對其安全性作出評價(jià)，以期為蓮子心總生物堿的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1800型紫外可見光分光光度計(jì)；Bayer ADVIA2400全自動生化分析儀（德國西門子）及其他一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。

蓮子心（湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，規(guī)格500 g，批號：20140101）；其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康昆明種（KM）小鼠（18±2）g 20 只，雌雄各半，Sprague-Dawley（SD）大鼠（200±20） g 40 只，雌雄各半，均由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號：SCXK （鄂）2014-0013）。 標(biāo)準(zhǔn)SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（23±2）℃，相對濕度 60%～70%，12 h白晝黑夜交替。動物適應(yīng)環(huán)境一周，期間均采用標(biāo)準(zhǔn)化飲食且不受限制。本研究獲得武漢大學(xué)倫理委員會和動物實(shí)驗(yàn)控制及監(jiān)督委員會的同意與支持。

1.3 蓮子心總生物堿制備

稱取蓮子心100 g，固液比 1∶3，加入75%乙醇充分混合后超聲提取3次，每次1 h。過濾后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，浸膏溶液加1%鹽酸調(diào)至pH 1～2，過濾，濾液用1%氨水調(diào)至pH 9～10，用等體積的氯仿萃取2次，合并氯仿層，用無水硫酸鈉脫水，過濾，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿得浸膏，用1%鹽酸溶解后轉(zhuǎn)移到燒杯中，1%氨水調(diào)至pH 9～10析出沉淀，加水300 mL左右靜置，用砂芯漏斗過濾得沉淀，冷凍干燥得蓮心總堿粉末（LPTA）2.67 g，提取率為2.67%。

1.4 蓮子心總生物堿急性毒性試驗(yàn)

KM小鼠按性別、體重隨機(jī)分為對照組與給藥組，每組10只。LPTA溶于0.3%羧甲基纖維素鈉（0.3%CMC-Na）的溶液中備用。給藥組以小鼠最大灌胃容積0.2 mL/10 g給藥，對照組小鼠給以等量容積0.3%羧甲基纖維素鈉（0.3%CMC-Na）。給藥后小鼠自由正常飲食，7 d內(nèi)密切觀察小鼠死亡率、日?；顒?、精神狀態(tài)以及飲食情況。

1.5 蓮子心總生物堿長期毒性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 動物分組與采樣將SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別作為LPTA高、中、低劑量給藥組和對照組。根據(jù)《中國藥典》蓮子心用量以及人和動物間按體表面積折算，相當(dāng)于大鼠的等效劑量為13.67 mg·kg-1[3]。因此給藥組分別按照劑量 400、200、100 mg·kg-1qd給予大鼠口服灌胃蓮子心總生物堿提取物，連續(xù)給藥30 d；對照組給予大鼠灌服等體積0.3%CMC-Na，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)期間，密切觀察大鼠進(jìn)食、飲水量以及日?；顒印５?0天兩組給藥2 h后禁食16 h，行心臟取血采集血樣，血樣于4℃、3500 r·min-1離心15 min，取上清液并分裝，用于血清生化指標(biāo)檢測。

1.5.2 檢測指標(biāo)及方法大鼠待測血清采用ADVIA2400全自動生化分析儀檢測，檢測指標(biāo)為肝、腎、心、血糖、血脂生化分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、膽堿酯酶（CHE）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）；尿 素 氮 （BUN）、肌 酐 （Cr）、鈣 （Ca2+）、 鈉（Na+）、鉀（K+）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）；總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和血糖（Glu）共 20 個(gè)指標(biāo)。

1.5.3 病理組織切片觀察取4組大鼠肝組織用生理鹽水洗凈，紗布吸干，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，作病理切片，顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

一次性口服給藥LPTA最大劑量達(dá)到5000 mg·kg-1時(shí)，7 d內(nèi)給藥組小鼠均未出現(xiàn)中毒死亡現(xiàn)象。與對照組相比，72 h內(nèi)給藥組小鼠精神狀態(tài)明顯下降，日?；顒恿匡@著減少，表現(xiàn)為嗜睡、閉眼、食欲減少、弓背。72 h后觀察，給藥組小鼠逐步恢復(fù)正常生活，飲食正常，活動量增加，直至7 d后觀察發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠日常活動、精神狀態(tài)、飲食進(jìn)水量與對照組小鼠相比均無差異，可推斷7 d后LPTA對小鼠正常生活無影響。因此，可推斷小鼠對LPTA的最大耐受量可達(dá)到5000 mg·kg-1。

供給情況：國產(chǎn)鉀方面，鹽湖裝置正常運(yùn)作，廠家?guī)齑婢S持低位；青海鹽湖上調(diào)11月報(bào)價(jià)，基準(zhǔn)產(chǎn)品60%晶粉到站價(jià)上調(diào)50元/噸至2400元/噸，恢復(fù)返利政策50元/噸。進(jìn)口鉀方面，到船量仍較少，大合同貨源預(yù)計(jì)11月中下旬開始到貨；港口鉀庫存降至160萬噸左右，62%俄白鉀主流報(bào)價(jià)降至2480-2500元/噸。邊貿(mào)鉀方面，庫存一般，到貨量略增，但可售現(xiàn)貨仍較少，62%俄白鉀報(bào)價(jià)維持在2250-2300元/噸。

2.2 長期毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 大鼠血清生化檢測結(jié)果

（1）LPTA對大鼠血清肝臟生化指標(biāo)的影響

連續(xù)服用蓮子心總生物堿提取物30天后，不同劑量組的血清肝臟生化指標(biāo)與對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 蓮子心總生物堿對大鼠血清肝臟生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）

表1 蓮子心總生物堿對大鼠血清肝臟生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別對照組ALT/U·L-1 34.30±1.26 ALP/U·L-1 149.60±4.69 TBIL/μmol·L-1CHE/U·L-1 0.33±0.031001.00±23.72 TP/g·L-1 55.00±0.84 ALB/g·L-1 34.01±0.52 GLB/g·L-1 21.36±0.36 400 mg·kg-135.10±0.96150.20±6.180.28±0.041010.80±31.3257.08±0.7635.01±0.6222.42±0.59 LPTA 200 mg·kg-131.40±1.87157.70±6.780.30±0.041048.10±33.7856.91±0.6834.59±0.4021.59±0.57 100 mg·kg-1 F P 33.25±0.69 1.68 0.19 144.30±6.35 0.83 0.49 0.32±0.03 0.37 0.77 971.20±13.95 1.33 0.28 55.88±1.07 1.29 0.29 35.25±0.28 0.95 0.43 22.96±0.83 1.47 0.24

（2）LPTA對大鼠血清腎臟生化指標(biāo)和無機(jī)離子的影響

連續(xù)服用LPTA 30 d后，SD大鼠的血清尿素氮含量顯著低于對照組含量（P＜0.05），但未呈現(xiàn)劑量依賴型。其余腎臟生化指標(biāo)與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 2。

（3）LPTA對大鼠血清心肌損傷生化指標(biāo)的影響

SD大鼠血清心肌損傷常見指標(biāo)見表3，高劑量組和中劑量組SD大鼠血清CK含量明顯低于對照組（P＜0.05）。

（4）LPTA對大鼠血脂和血糖的影響

口服400、200 mg·kg-1LPTA的高、中劑量組SD大鼠血糖含量明顯低于對照組，且具有劑量依賴性（P＜0.05）。 見表 4。

2.2.2 LPTA對大鼠肝組織形態(tài)學(xué)影響蓮子總生物堿提取物對大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響見圖1。對照組大鼠肝組織病理切片中可明顯觀察到清晰可見呈發(fā)射狀的中央靜脈，染成藍(lán)色的細(xì)胞核形態(tài)清晰完整。與對照組（圖1-A）相比，低劑量（圖1-B）和中劑量（圖1-C）組肝組織病理學(xué)形態(tài)未觀察到明顯變化，高劑量（圖1-D）與前3組相比，細(xì)胞核數(shù)目減少，肝細(xì)胞無明顯腫脹，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。

表2 蓮子心總生物堿對大鼠血清腎臟生化指標(biāo)和無機(jī)離子的影響（n=10，±s）

表2 蓮子心總生物堿對大鼠血清腎臟生化指標(biāo)和無機(jī)離子的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別對照組400 mg·kg-1 BUN/mmol·L-1 5.12±0.18 4.57±0.07*Cr/μmol·L-1 24.90±1.40 26.40±0.79 Ca2+/mmol·L-1 2.57±0.04 2.65±0.03 Na+/mmol·L-1 141.00±0.42 143.10±0.53 K+/mmol·L-1 4.87±0.09 4.51±0.21 LPTA 200 mg·kg-14.64±0.12*26.00±0.802.65±0.02142.20±0.394.94±0.14 100 mg·kg-1 F P 4.66±0.33*3.54 0.02 25.10±0.71 0.55 0.65 2.63±0.03 1.60 0.21 141.90±0.60 3.09 0.14 4.54±0.10 2.32 0.09

表3 蓮子心總生物堿對大鼠血清心肌損傷生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）

表3 蓮子心總生物堿對大鼠血清心肌損傷生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

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3 討 論

生物堿在自然界中廣泛分布，由于其結(jié)構(gòu)多樣，具有豐富的生理和藥理活性。但同時(shí)，部分生物堿的毒性作用使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。本研究從新鮮蓮子心中提取總生物堿，100 g生藥可得到2.67 g總生物堿，提取率為2.67%。

表4 蓮子心總生物堿對大鼠血脂和血糖的影響（n=10，±s）

表4 蓮子心總生物堿對大鼠血脂和血糖的影響（n=10，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組 別TCH/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL/mmol·L-1LDL/mmol·L-1Glu/mmol·L-1 0.57±0.06 0.16±0.01 10.46±0.56 1.53±0.09 0.37±0.06 0.56±0.05 0.16±0.02 8.17±0.32*1.52±0.16 0.36±0.08 0.55±0.10 0.15±0.01 8.90±0.58*1.52±0.07 0.38±0.08 0.56±0.04 0.13±0.01 9.83±0.49 F 0.22 0.16 0.07 1.31 4.09 P 0.88 0.92 0.97 0.29 0.01對照組1.63±0.090.38±0.12 LPTA 400 mg·kg-1 200 mg·kg-1 100 mg·kg-1

圖1 蓮子心總生物堿對大鼠肝組織形態(tài)學(xué)影響（H ＆ E染色，×100倍）

本研究結(jié)果顯示，蓮子心總生物堿的急性毒性試驗(yàn)中，口服蓮子心總生物堿劑量高達(dá)5000 mg·kg-1均未出現(xiàn)口服毒性，在密切觀察的7 d內(nèi)，蓮子心總生物堿未引起任何與治療相關(guān)的中毒癥狀或者出現(xiàn)小鼠死亡例數(shù)?？诜?000 mg·kg-1蓮子心總生物堿的小鼠在72 h內(nèi)出現(xiàn)較對照組小鼠行動遲緩以及嗜睡等癥狀，推測其可能原因?yàn)橐淮涡越o藥體積大以及給藥濃度的增加，對小鼠的日?；顒釉斐捎绊?，且蓮子心總生物堿味苦，影響小鼠的正常飲食，但在72 h后給藥組小鼠行動恢復(fù)正常，7 d后給藥組小鼠與對照組小鼠行為活動等方面已無明顯差異，可能與蓮子心總生物堿在小鼠體內(nèi)的排泄或代謝較快相關(guān)[4]。由于蓮子心總生物堿不溶于水而溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，以及小鼠口服0.3%CMC-Na半數(shù)致死率（LD50）可達(dá) 27 g·kg-1[5]，說明本研究采用0.3%CMC-Na作為溶媒具有安全性。因此，小鼠對蓮子心總生物堿的LD50要大于5000 mg·kg-1，本研究檢測其最大給藥耐受量為5000 mg·kg-1。

為進(jìn)一步探討蓮子心總生物堿連續(xù)給藥產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，采用 30 d 連續(xù)給藥，以 400、200、100 mg·kg-1·d-1作為不同劑量組考察蓮子心總生物堿與血清生化指標(biāo)間的量效關(guān)系。結(jié)果表明，在連續(xù)30 d的口服毒性試驗(yàn)中，4組大鼠均未觀察到與蓮子心總生物堿相關(guān)的中毒癥狀以及死亡例數(shù)。為避免單一因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偶然誤差，本研究在評價(jià)蓮子心總生物堿對大鼠肝臟活性的影響時(shí)，同時(shí)檢測了7項(xiàng)臨床常用生化指標(biāo)。研究結(jié)果表明，4組大鼠血清 ALT、ALP、TBIL、CHE、TP、ALB、GLB 含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明蓮子心總生物堿對肝臟生化指標(biāo)不造成影響。連續(xù)口服蓮子心總生物堿30 d，給藥組大鼠BUN含量相對于對照組顯著性降低（P≤0.05），但這些差異并不是由于蓮子心總生物堿相關(guān)的病理學(xué)改變而引起，而且4組大鼠檢測結(jié)果均在SD大鼠血清BUN正常值變動范圍內(nèi)[6]，Cr、Ca2+、Na+、K+均無顯著性差異，說明蓮子心總生物堿對大鼠腎臟和無機(jī)離子活性無影響。本研究結(jié)果顯示 400、200 mg·kg-1·d-1的蓮子心總生物堿使 SD 大鼠血清中CK、Glu含量顯著性降低，推測蓮子心總生物堿具有良好的抗心律失常作用，以及抑制脂肪形成而與抗肥胖作用相關(guān)[7]，但數(shù)據(jù)變動均在實(shí)驗(yàn)值正常范圍內(nèi)。其余指標(biāo)包括AST、LDH、TCH、TG、HDL、LDL在4組大鼠間比較均無顯著性差異。

根據(jù)SD大鼠肝臟組織病理切片結(jié)果可客觀地反映出蓮子心總生物堿對大鼠臟器無毒副作用。因此，口服蓮子心總生物堿對SD大鼠無毒副作用，并且劑量可高達(dá) 400 mg·kg-1·d-1。

綜上所述，長期口服劑量高達(dá)400 mg·kg-1·d-1蓮子心總生物堿不會導(dǎo)致血清生化指標(biāo)的異常，也不會引起內(nèi)臟器官不正常的病理變化。因此，本研究可在一定程度上證明蓮子心總生物堿的安全性，為其今后更廣泛地應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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