袁玲，聶衛(wèi)，高萍，陳斌，劉偉偉，崔曉雪

雷帕霉素洗脫支架損傷血管內(nèi)皮的作用機(jī)制探討

袁玲，聶衛(wèi)，高萍，陳斌，劉偉偉，崔曉雪

目的探討雷帕霉素洗脫支架損傷血管內(nèi)皮的作用機(jī)制。方法（1）對兔行局部肌肉注射雷帕霉素（雷帕霉素組），模擬雷帕霉素洗脫支架安全性評價中的肌肉植入，同時設(shè)正常對照組和丙酮對照組。觀察各組形態(tài)變化及測定勻漿液鈣含量。（2）采用雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）48 h及1 μg/L雷帕霉素處理HUVEC 6、12、24及48 h，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，分析細(xì)胞存活率與藥物濃度及處理時間的關(guān)系。（3）HUVEC分設(shè)正常對照組、1 μg/L雷帕霉素組。48 h后HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用NO檢測試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量，采用Fluo-3/AM熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+。結(jié)果（1）雷帕霉素組出現(xiàn)支架植入類似的藍(lán)染表現(xiàn)，雷帕霉素組較正常對照組和丙酮對照組鈣含量升高（P＜0.05）。（2）雷帕霉素處理HUVEC后，細(xì)胞存活率隨濃度增加和時間延長均呈逐漸降低趨勢（P＜0.01）。（3）雷帕霉素組細(xì)胞胞漿出現(xiàn)空泡、核固縮及核碎裂，與正常對照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量降低，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量增高（P＜0.05）。結(jié)論雷帕霉素洗脫支架中抗增殖藥雷帕霉素對血管內(nèi)皮有損傷作用，其機(jī)制可能與引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高有關(guān)。

西羅莫司；內(nèi)皮，血管；藥物洗脫支架；臍靜脈；鈣；疾病模型，動物

冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)已成為治療冠心病的重要手段之一。雷帕霉素洗脫支架因能抑制細(xì)胞增生、發(fā)揮抗狹窄作用而得到了較快發(fā)展，但其易造成內(nèi)皮化延遲，進(jìn)而增加血栓形成的風(fēng)險。血管內(nèi)皮的完整性和功能健全是防止血小板聚集和血栓形成的關(guān)鍵。目前有關(guān)雷帕霉素洗脫支架引起內(nèi)皮化延遲的因素爭議較多，包括支架聚合物涂層刺激［1］、支架引起的局部炎癥［2］和抗增殖藥物雷帕霉素局部釋

放［3］等。本研究采用抗增殖藥雷帕霉素對兔行局部肌肉注射，模擬該支架安全評價（安評）實(shí)驗(yàn)中肌肉植入實(shí)驗(yàn)并作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），旨在探討雷帕霉素是否可引起內(nèi)皮損傷及其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料普通級日本大耳白兔18只，雌性，平均體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，合格證號：11400800000295。HUVEC及其完全培養(yǎng)液（HUVEC-004）購自美國ALLCELLS公司；0.25%胰酶購自gibco公司；雷帕霉素購自華北制藥集團(tuán)公司；四噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Amresco公司；鈣離子熒光探針Fluo-3 AM、嵌段式聚醚F-127（Pluronic 127）購自美國Biotium公司；NO測定試劑盒購自南京建成生物工程所。

1.2 模型制作及分組日本大耳白兔18只，隨機(jī)數(shù)字表法均分為3組。雷帕霉素組：模擬雷帕霉素洗脫支架安全性評價的肌肉植入實(shí)驗(yàn)，于兔背部剪毛備皮后，以戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射35 mg/kg麻醉，經(jīng)背部正中切開皮膚，于脊柱左右側(cè)分別注射3處雷帕霉素溶液0.1 mL，間隔1.5 cm，濃度為2 000 mg/L（支架載藥量一般為100～200μg），距離注射處1.5 cm縫線標(biāo)記。正常對照組和丙酮對照組以同樣的方法分別注射0.1 mL生理鹽水和純丙酮。各組分別于3、7 d處死3只，每只取左側(cè)3塊注射部位肌肉組織固定于10%中性福爾馬林中，進(jìn)行組織病理制片，行HE染色后觀察，并與安評實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素洗脫支架肌肉植入7 d的組織切片進(jìn)行比對；右側(cè)3塊局部肌肉組織勻漿后于全自動生化分析儀測勻漿液鈣含量。本研究對動物的處理方法符合動物倫理學(xué)要求。

1.3 HUVEC培養(yǎng)及MTT檢測細(xì)胞存活率將HUVEC培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁并生長至80%以上融合時，用0.25%胰酶消化傳代。將對數(shù)生長期的HUVEC用0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按5 000個/孔密度接種于96孔板，分為：（1）正常對照組，磷酸鹽緩沖液刺激。（2）雷帕霉素組，分別給予雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L處理48 h，以及參照文獻(xiàn)［4］雷帕霉素1 μg/L處理6、12、24及48 h。各組均按常規(guī)MTT法于相應(yīng)處理后檢測細(xì)胞存活率。每組設(shè)置6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 HE染色觀察HUVEC損傷形態(tài)的變化將HUVEC接種于6孔板，分為正常對照組、雷帕霉素組。待細(xì)胞貼壁后，雷帕霉素組給予含1 μg/L雷帕霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，正常對照組給予同體積的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，處理48 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，95%乙醇固定10 min，HE染色，倒置顯微鏡觀察并采圖。

1.5 HUVEC培養(yǎng)液NO含量檢測將HUVEC接種于6孔板，分組處理同1.4，處理48 h后，收集2組細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明處理，用721型可見光分光光度儀測定550 nm的吸光度（A）值。根據(jù)所得的A值，計(jì)算NO的濃度=（測定管A值-空白管A值）/（標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣品測試前的稀釋倍數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測胞質(zhì)Ca2+濃度將HUVEC接種于6孔板，分組同1.4，處理48 h后，消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每100 μL細(xì)胞懸液加入1 μL Fluo-3/AM的比例，使溶液終濃度為4.4 μmol/L，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次后，室溫孵育20 min，流式細(xì)胞儀（美國BD公司）上用FLl通道檢測熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm），重復(fù)測量3次，并使用FCS Express 4.0軟件分析10 000個細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部肌肉組織變化及勻漿液鈣含量安評中肌肉植入最短時間點(diǎn)為7 d，因而本組缺乏3 d安評HE染色結(jié)果。7 d時，正常對照組可見肌肉組織形態(tài)正常；丙酮對照組可見壞死肌肉呈均質(zhì)紅染；雷帕霉素組可見壞死肌肉呈藍(lán)染表現(xiàn)，安評實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素洗脫支架肌肉植入組可見壞死肌肉呈藍(lán)染表現(xiàn)，見圖1。雷帕霉素組較正常對照組和丙酮對照組鈣含量升高（P＜0.05），2對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Fig.1Effect of rapamycin on local morphological changes upon intramuscular injection（HE，×100）圖1 不同處理后各組細(xì)胞組織形態(tài)改變（HE，×100）

2.2 HUVEC存活率正常對照組細(xì)胞存活率為100%，雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L處理HUVEC 48 h后，細(xì)胞的存活率分別降低為（81.2±2.5）%、

（67.3±3.2）%、（57.5±4.4）%、（50.3±3.8）%（F= 117.006，P＜0.01），HUVEC存活率減少呈濃度依賴性（rs=-0.639，P＜0.05）。與正常對照組比較，1 μg/L雷帕霉素處理HUVEC 6、12、24及48 h后，細(xì)胞的存活率分別降低為（94.1±1.9）%、（89.2±2.3）%、（81.6±3.5）%及（69.8±3.2）%（F=62.101，P＜0.01）。

2.3 HUVEC形態(tài)正常對照組可見細(xì)胞呈橢圓形、多角形、短梭形、單層鋪路石樣排列，邊界清，胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核，見圖2A；雷帕霉素組可見細(xì)胞腫脹，胞漿出現(xiàn)空泡，部分細(xì)胞核固縮、核碎裂，有些壞死固縮細(xì)胞在染色過程中脫落，見圖2B。

Tab.1Comparison of calcium content in cell homogenate between all three groups表1 各組勻漿液鈣含量結(jié)果比較（n=3，mmol/L，）

Tab.1Comparison of calcium content in cell homogenate between all three groups表1 各組勻漿液鈣含量結(jié)果比較（n=3，mmol/L，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與丙酮對照組比較，均P＜0.05

組別正常對照組丙酮對照組雷帕霉素組F 3 d 1 . 2 0 ± 0 . 0 5 1 . 3 0 ± 0 . 1 2 8 . 7 8 ± 1 . 2 0ab1 1 6 . 8 4 1＊＊7 d 1 . 2 0 ± 0 . 0 4 1 . 4 0 ± 0 . 1 0 1 3 . 5 0 ± 2 . 3 0ab8 1 . 2 7 2＊

Fig.2Effect of rapamycin on cell morphology of HUVEC圖2 雷帕霉素處理對HUVEC形態(tài)的影響（HE，×100）

2.4 HUVEC的NO變化情況雷帕霉素組NO含量低于正常對照組［（26.4±1.7）μmol/L vs（61.9±4.6）μmol/L，t=12.599，P＜0.01］。

2.5 HUVEC Ca2+含量變化雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平高于正常對照組［（5 055±243）F1 vs（1 384± 45）F1，t=25.637，P＜0.01］，見圖3。

Fig.3Effect of rapamycin on intracellular-free Ca2+levels of HUVEC圖3 雷帕霉素處理對HUVEC Ca2+含量的影響

3 討論

雷帕霉素洗脫支架通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖以預(yù)防再狹窄的發(fā)生，但其在抑制平滑肌細(xì)胞增生的同時，也抑制了損傷動脈的愈合及內(nèi)皮化，因而可能導(dǎo)致局部延遲愈合，增加了遲發(fā)性血栓形成的風(fēng)險，對藥物涂層支架的長期療效產(chǎn)生不利影響。盡管患者在植入雷帕霉素洗脫支架后長期應(yīng)用抗血小板聚集治療，但相對裸支架，經(jīng)藥物洗脫支架治療的患者中晚期不良事件的發(fā)生亦更多見，支架內(nèi)血栓雖然罕見但危害極大，常常會導(dǎo)致心肌梗死和猝死［5］。

目前，對于雷帕霉素洗脫支架引起內(nèi)皮化延遲的因素爭議較多。有學(xué)者認(rèn)為這可能與支架聚合物涂層局部刺激有關(guān)，相關(guān)研究多致力于開發(fā)更多的生物可降解聚合物支架、可吸收支架及無聚合物載體藥物支架等［6］。但隨后有研究顯示，無藥物覆載的可降解鎂合金支架（AMS-1），45%的管腔回縮歸因于支架置入6個月時的血管內(nèi)膜過度增生，覆載增殖藥物的洗脫釋放是必不可少的［7］。也有學(xué)者認(rèn)為，雷帕霉素洗脫支架引起內(nèi)皮化延遲和支架引起的局部炎癥有關(guān)，認(rèn)為局部炎癥抑制內(nèi)皮修復(fù)，導(dǎo)致血小板激活和黏附、聚集，從而增加了遲發(fā)性血栓形成的風(fēng)險［2］。目前較多的研究認(rèn)為，其和抗增殖藥物雷帕霉素局部緩慢釋放有關(guān)［3，8］。因此，當(dāng)前對于雷帕霉素洗脫支架植入后有關(guān)內(nèi)皮化延遲及其發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識還不夠明晰。

本研究顯示，該支架對家兔肌肉植入組織有特異的組織壞死表現(xiàn)，不同于一般肌肉壞死均質(zhì)粉染的表現(xiàn)，其呈現(xiàn)藍(lán)染表現(xiàn)，在對兔行雷帕霉素注射后，局部肌肉組織HE染色觀察結(jié)果顯示，其能出現(xiàn)與其支架植入后一致的病理表現(xiàn)，提示可能是雷帕霉素藥物而不是涂層聚合物抑制了損傷動脈的愈合及內(nèi)皮化。Holy等［3］亦認(rèn)為抗增殖藥雷帕霉素可造成內(nèi)皮化延遲。

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，亦有免疫抑制作用，能抑制細(xì)胞的增殖。作為藥物涂層支架的主要應(yīng)用藥物之一，雷帕霉素在局部冠狀動脈緩慢釋放，可能會對局部冠脈內(nèi)皮包括損傷處及周圍產(chǎn)生毒性。本研究顯示，雷帕霉素處理HUVEC后，細(xì)胞存活率隨濃度增加和時間延長均呈逐漸降低趨勢，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化明顯，雷帕霉素組NO含量低于正常對照組，表明隨作用濃度增加及作用時間延長，雷帕霉素降低內(nèi)皮細(xì)胞存活率、減少NO分泌量的能力亦增強(qiáng)，證實(shí)了其能抑制血管內(nèi)皮增殖并損害其功能，此與Jin等［9］研究相近。

另外，本研究顯示，雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量

高于正常對照組，表明雷帕霉素明顯增加了局部組織鈣含量。為鑒定雷帕霉素引起的鈣增高來源于組織間隙還是細(xì)胞內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)采用FLUO-3AM熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度改變情況，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，雷帕霉素能增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣含量，提示雷帕霉素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損害可能與其造成的細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

綜上所述，雷帕霉素作為藥物涂層支架的主要藥物之一，可能是支架區(qū)內(nèi)皮覆蓋延遲，繼而引起血栓形成的主要因素。雷帕霉素抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖并損害其功能，從而造成內(nèi)皮化延遲的機(jī)制可能與雷帕霉素引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

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（2015-05-18收稿 2015-08-11修回）

（本文編輯 陸榮展）

The role of rapamycin-eluted stent in vascular endothelial injury

YUAN Ling，NIE Wei，GAO Ping，CHEN Bin，LIU Weiwei，CUI Xiaoxue
Tianjin Institute of Medical Science，Tianjin 300020，China

ObjectiveTo explore the mechanism of rapamycin-eluted stent in vascular endothelial injury.Methods（1）Rapamycin（rapamycin group）was injected to rabbit dorsum muscle to simulate rapamycin-eluted stent implantation into muscles.Control group and acetone control group were established at the same time.Morphological change in muscle was observed and serum calcium levels were measured after rapamycin injection.（2）HUVECs were incubated with 0.1，1，10 and 100 μg/L rapamycin for 48 h respectively or with 1 μg/L rapamycin for 6，12，24 and 48 h respectively．Cell viability was examined by MTT and its relationship with drug concentration and treatment time were analyzed.（3）HUVECs were divided into control group and 1 μg/L rapamycin group.After 48 h，morphological changes of HUVECs were assessed by HE staining，the production of nitric oxide was examined by Nitric Oxide Assay Kit and the intracellular calcium ion concentration was tagged with Fluo-3/AM.Results（1）Organizational morphology in local muscle with rapamycin injection represent stent implantation of rabbit，and calcium content in local muscle increased significantly in rapamycin group compared with nomal control group and acetone control group（P＜0.05）.（2）Cell survival rate decreased significantly upon administration of rapamycin in both concentration and time dependent manner（P＜0.01）.（3）In rapamycin group，cytoplasm vacuoles，nucleus pycnosis and nuclear fragmentation were observed；compared with control group，the levels of intracellular free Ca2+increased while the levels of nitric oxide was reduced.ConclusionRapamycin treatment lead of injury to vascular endothelial cells which might through up-regulating intracellular Ca2+level.

Sirolimus；endothelium，vascular；drug-eluting stents；umbilical veins；calcium；disease models，animal

R543.3，R965.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.015

天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2013KY37）

天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（郵編300020）

袁玲（1979），女，助理研究員，碩士，主要從事藥物毒理、病理，醫(yī)療器械安全性評價方面研究