馮 磊, 張 蘭, 張燕寧, 張 佩, 蔣紅云

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

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三種新煙堿類農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體重及溶酶體膜的影響

馮 磊, 張 蘭, 張燕寧, 張 佩, 蔣紅云*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

新煙堿類農(nóng)藥的大量使用,導(dǎo)致非靶標(biāo)生物受到威脅,如美國(guó)蜜蜂種群數(shù)量銳減等。蚯蚓作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的一種重要?jiǎng)游?是生態(tài)環(huán)境安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)化人工土壤法,研究了吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉3種新煙堿類農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體重?fù)p失率和體腔細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,僅高濃度吡蟲啉(1.6 mg/kg)、噻蟲啉(6.4 mg/kg)和氯噻啉(1.6 mg/kg)對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)有抑制作用;3種藥劑對(duì)體腔細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性的影響具有時(shí)間和劑量效應(yīng),對(duì)溶酶體膜的毒性作用隨著藥劑濃度增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。相同劑量下,處理7 d時(shí),氯噻啉引起的蚯蚓體重?fù)p失率顯著高于吡蟲啉和噻蟲啉;而對(duì)于溶酶體膜的毒性,在處理第2天時(shí),氯噻啉顯著高于吡蟲啉和噻蟲啉。同時(shí),蚯蚓體腔細(xì)胞溶酶體膜中性紅保留時(shí)間較蚯蚓體重?fù)p失率更為敏感,更適合于監(jiān)測(cè)低劑量污染物對(duì)非靶標(biāo)生物的影響。

新煙堿類農(nóng)藥; 體重?fù)p失率; 溶酶體膜; 中性紅保留時(shí)間; 蚯蚓

新煙堿類殺蟲劑是防治刺吸式害蟲如蚜蟲、煙粉虱、葉蟬和稻飛虱、薊馬及一些微型鱗翅目和鞘翅目害蟲的有效殺蟲劑[1]。1991年拜耳公司推出第一個(gè)新煙堿類化合物吡蟲啉后,由于該類藥劑具有殺蟲譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)、殘效期長(zhǎng)和作用機(jī)制新穎獨(dú)特等特點(diǎn),使其成為一類發(fā)展最快的化學(xué)殺蟲劑[2]。在之后的10年,又涌現(xiàn)出6個(gè)新煙堿類殺蟲劑：啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、噻蟲胺、呋蟲胺。到2006年,新煙堿類殺蟲藥劑的銷售額達(dá)到15.6億美元,占全球農(nóng)藥市場(chǎng)的17%[3]。但是,有研究報(bào)道,新煙堿類殺蟲藥劑對(duì)非靶標(biāo)生物如蜜蜂等有負(fù)面影響[4-5]。因此,新煙堿類殺蟲藥劑的使用以及對(duì)非靶標(biāo)生物的影響引起了廣泛關(guān)注。

蚯蚓作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中一種重要?jiǎng)游?它以土壤有機(jī)質(zhì)為食物,通過(guò)掘洞、消化有機(jī)質(zhì)、排泄糞便等直接改變土壤微生物和植物的生存環(huán)境[6-8]。同時(shí),蚯蚓通常被視為生態(tài)系統(tǒng)中的代表類群而被用于指示、監(jiān)測(cè)土壤污染,是生態(tài)環(huán)境安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。

有研究表明,農(nóng)藥在使用過(guò)程中,僅有1%作用于靶標(biāo)生物,其余的或殘留于土壤,或通過(guò)地表徑流、淋溶或干濕沉降的方式進(jìn)入水體,從而對(duì)土壤生物和水生生物產(chǎn)生不利影響[10-11]。而以蚯蚓為供試物,對(duì)新煙堿類殺蟲劑的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉為供試毒物,從體重?fù)p失率和體腔細(xì)胞溶酶體膜保留時(shí)間等方面研究其對(duì)蚯蚓的毒性,為進(jìn)一步的毒性試驗(yàn)研究提供必要的基礎(chǔ)資料,同時(shí)也為新煙堿類殺蟲劑的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生物

赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)指定蚯蚓種,從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院引種,對(duì)污染物具有中等的敏感性,試驗(yàn)時(shí)取環(huán)帶明顯且大小較一致的健康成蚓。飼養(yǎng)條件：空氣濕度80%～85%;溫度(20±1)℃;自然光照。

1.2 供試藥劑

96.0%的吡蟲啉原藥(山東聯(lián)合山東聯(lián)合化工股份有限公司)、98.3%的噻蟲啉原藥(天津興光農(nóng)藥有限公司)和90.0%的氯噻啉原藥(廣西田園生化股份有限公司)。試驗(yàn)中所示濃度均為藥物的有效成分含量。中性紅和乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)買自AMRESCO公司;臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)買自Sigma公司;其他常規(guī)試劑均為分析純,購(gòu)自北京化工廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)前處理

試驗(yàn)前挑取生殖環(huán)帶明顯、體重在350～500 mg之間的蚯蚓放在濕度35%的人工土壤中(10%泥炭蘚、20%高嶺土和70%石英砂,碳酸鈣調(diào)節(jié)pH),在空氣濕度80%～85%、溫度(20±1)℃、pH(6.0±0.5)、自然光照條件下,清腸24 h。

1.3.2 體重?fù)p失率測(cè)定

采用OECD標(biāo)準(zhǔn)化人工土壤法[12]。在正式試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和推薦施用量確立試驗(yàn)農(nóng)藥濃度范圍,吡蟲啉和氯噻啉均為0.1、0.4和1.6 mg/kg,噻蟲啉為0.4、1.6和6.4 mg/kg。分別稱取一定量吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉原藥先溶于10 mL丙酮中,與50 g人工土壤混合均勻,待丙酮充分揮發(fā)后,再與450 g人工土壤混合均勻,加入蒸餾水,使土壤持水量達(dá)到35%,放入1 L標(biāo)本瓶中,每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓,用保鮮膜封口,放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件為：溫度(20±1)℃,濕度80%,光暗比為L(zhǎng)∥D=12 h∥12 h。對(duì)照只加10 mL丙酮,其他與處理相同。第1天在土壤表面投放5 g牛糞,之后每星期投放等量牛糞。采樣：分別在施藥后第2、7、14和28天收集蚯蚓,用蒸餾水沖洗干凈,再用濾紙吸干水分,稱重,并記錄。利用公式計(jì)算其體重?fù)p失率：Ic=(W0-Wt)/W0×100%,式中c是處理農(nóng)藥的含量;Ic是c含量農(nóng)藥處理后的蚯蚓體重?fù)p失率,W0和Wt分別是試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)第t天時(shí)蚯蚓的平均體重[13-14]。

1.3.3 溶酶體中性紅染色保留時(shí)間

1.3.3.1 蚯蚓染毒

方法和濃度同第一步試驗(yàn)。不同的是不添加牛糞,分別在施藥后第2、7和14天收集蚯蚓。

1.3.3.2 體腔液提取

參照Eyambe等的方法[15]。藥劑處理后的蚯蚓,放在4 ℃生理鹽水浸濕的濾紙上清腸24 h后,再放入5 mL離心管中,加入3 mL體腔細(xì)胞提取液,刺激3 min后,棄去蚯蚓,剩余液體與17 mL蚯蚓生理林格氏(Ringer)溶液混合,振蕩,在4 ℃,150 g下離心5 min,棄去上清液,用1 mL蚯蚓生理林格氏溶液重懸沉淀物,4 ℃下保存?zhèn)溆?。體腔細(xì)胞提取液：5%乙醇,95%生理鹽水,2.5 mg/mL EDTA,pH 7.2。蚯蚓生理林格氏溶液配方：氯化鈉4.14 g;氯化鉀0.354 9 g;氯化鈣4.14 g;硫酸鎂0.270 6 g;磷酸二氫鉀0.054 4 g;磷酸氫二鈉0.042 6 g;碳酸氫鈉0.252 7 g。加三蒸水至1 000 mL,然后高壓滅菌,4 ℃下保存,pH 7.2。

1.3.3.3 細(xì)胞活性測(cè)定

體腔細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9∶1混合均勻,顯微鏡下觀察,分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率。

1.3.3.4 中性紅保留時(shí)間測(cè)定

參照Weeks等[16]的方法。首先將20 mg中性紅溶于1 mL二甲基亞砜,配制成中性紅母液,取10 μL的母液加入到2.5 mL的蚯蚓生理林格氏溶液中,混合得到濃度為80 μg/mL的工作液。然后吸取20 μL的體腔液,加入相同體積的蚯蚓生理林格氏溶液,取20 μL體腔液和林格氏溶液的混合液滴到顯微鏡的載玻片上。等待30 s使其附著在載玻片上,再加入20 μL的中性紅工作液,蓋上蓋玻片。計(jì)時(shí)開(kāi)始,在400倍顯微鏡下鏡檢,每隔2 min觀察1次,不觀察時(shí)放于人工氣候箱,直到視野中超過(guò)50%的體腔細(xì)胞被染成粉紅色(表明在體腔細(xì)胞中,染料已經(jīng)從溶酶體中滲出),這段時(shí)間稱為中性紅保持時(shí)間(NRRT)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,不同處理間體重?fù)p失率和中性紅保留時(shí)間采用兩組樣本均值差異t檢驗(yàn)方法進(jìn)行處理組之間的差異比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種新煙堿類殺蟲藥劑對(duì)蚯蚓體重的影響

如圖1所示,不同濃度的吡蟲啉處理不同時(shí)間后,只有1.6 mg/kg吡蟲啉處理在第2天對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)有抑制作用,蚯蚓體重?fù)p失率為12.15%,其他處理組蚯蚓體重均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但1.6 mg/kg處理組體重增加顯著慢于對(duì)照及0.1和0.4 mg/kg處理組。不同濃度的噻蟲啉處理不同時(shí)間后,0.4和1.6 mg/kg噻蟲啉對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,僅6.4 mg/kg噻蟲啉在第2、7、14和28天對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)有抑制作用,說(shuō)明6.4 mg/kg噻蟲啉明顯地抑制蚯蚓的生長(zhǎng)。氯噻啉與吡蟲啉的趨勢(shì)相同,0.1和0.4 mg/kg氯噻啉在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)都沒(méi)有抑制作用。只有1.6 mg/kg處理的蚯蚓在第2和7天對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)有抑制作用,蚯蚓體重?fù)p失率分別為17.24%和12.00%。通過(guò)差異顯著性分析,在相同劑量(0.4 mg/kg)處理下,3種藥劑處理組與對(duì)照組均沒(méi)有顯著差異,而在1.6 mg/kg處理第7天時(shí),氯噻啉處理后的蚯蚓體重?fù)p失率(12.00%)顯著高于吡蟲啉和噻蟲啉處理后的蚯蚓體重?fù)p失率(-1.10%和-15.34%)。

2.2 細(xì)胞活力

結(jié)果表明,提取的細(xì)胞體腔液離心,通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色,測(cè)定的細(xì)胞存活率大于90%,符合試驗(yàn)要求,并與Gupta[17]的報(bào)道相近。

2.3 三種新煙堿類殺蟲藥劑對(duì)蚯蚓溶酶體中性紅染色保留時(shí)間的影響

吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉各濃度組對(duì)蚯蚓溶酶體的中性紅保留時(shí)間的影響見(jiàn)圖2。隨著染毒劑量增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng),吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉對(duì)溶酶體膜的毒性作用增強(qiáng),且各染毒處理組的中性紅保留時(shí)間與對(duì)照組相比均顯著縮短。染毒2 d后,吡蟲啉(0.1 mg/kg)、噻蟲啉(0.4 mg/kg)和氯噻啉(0.1 mg/kg)對(duì)蚯蚓NRRT分別為(102.00±3.46)min、(53.33±5.03)min和(58.00±9.17)min,顯著低于對(duì)照組(117.33±11.02)min,吡蟲啉對(duì)蚯蚓溶酶體膜的損傷明顯低于噻蟲啉和氯噻啉,這可能是噻蟲啉和氯噻啉親水性比吡蟲啉高,更容易進(jìn)入蚯蚓體內(nèi),發(fā)揮作用。通過(guò)差異顯著性分析,在處理第2天時(shí),相同濃度(0.4 mg/kg)下,氯噻啉(42.00±4.00)min中性紅保留時(shí)間顯著低于吡蟲啉(82.67±7.57)min和噻蟲啉(53.33±5.03)min;而且在1.6 mg/kg下,氯噻啉(38.00±2.00)min中性紅保留時(shí)間也顯著低于吡蟲啉(62.67±3.06)min和噻蟲啉(45.33±3.05)min?？梢?jiàn),相同劑量下,處理第2天時(shí),氯噻啉對(duì)溶酶體膜的損傷顯著高于吡蟲啉和噻蟲啉。

圖2 不同濃度的吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉處理對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞溶酶體膜NRRT的影響Fig.2 Effects of different concentrations of imidacloprid,thiacloprid and imidaclothiz on the NRRT of earthworm coelomocytes

新煙堿類殺蟲藥劑會(huì)影響酶促反應(yīng)等正常的生理代謝[18],促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生,從而產(chǎn)生過(guò)多的自由基,削弱機(jī)體的抗氧化防御體系,造成細(xì)胞損傷[19]。脂質(zhì)過(guò)氧化是細(xì)胞損傷的一種特殊形式,也是許多毒物對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生作用的起點(diǎn)。脂質(zhì)過(guò)氧化效應(yīng)中最明顯的就是膜脂質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)受損,細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜的通透性改變,如溶酶體膜通透性改變[20]。因此,暴露于吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉的蚯蚓,在低濃度時(shí),在經(jīng)過(guò)2 d的暴露后,NRRT顯著縮短,表明NRRT作為一種敏感的生物標(biāo)志可用來(lái)指示低濃度藥劑對(duì)蚯蚓在亞細(xì)胞水平上產(chǎn)生的影響,從而作為土壤污染的預(yù)警系統(tǒng)對(duì)土壤污染做出快速的診斷。

3 結(jié)論

僅高濃度吡蟲啉(1.6 mg/kg)、噻蟲啉(6.4 mg/kg)和氯噻啉(1.6 mg/kg)對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)有抑制作用。

吡蟲啉、噻蟲啉和氯噻啉處理后蚯蚓體腔細(xì)胞溶酶體膜中性紅保留時(shí)間隨染毒劑量增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)而縮短。

相同劑量下,氯噻啉引起的蚯蚓體重?fù)p失率及對(duì)溶酶體膜的毒性要高于吡蟲啉和噻蟲啉。

蚯蚓體腔細(xì)胞溶酶體膜中性紅保留時(shí)間較蚯蚓體重?fù)p失率更為敏感,更適合于監(jiān)測(cè)低劑量污染物對(duì)蚯蚓的影響。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Effects of three neonicotinoids on the weight and neutral red retention time of earthworm (Eiseniafetida)

Feng Lei, Zhang Lan, Zhang Yanning, Zhang Pei, Jiang Hongyun

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Neonicotinoids are widely used to control a broad spectrum of sucking and some chewing pests, but they also have negative impacts on non-target organisms that attract more and more attention. Earthworms are considered as important bioindicators of chemical pollution in the soil ecosystem. In this study, the weight loss and neutral red retention time (NRRT) in the earthwormEiseniafetidatreated with imidacloprid, thiacloprid and imidaclothiz were investigated. Our results showed that high concentrations of imidacloprid (1.6 mg/kg), thiacloprid (6.4 mg/kg) and imidaclothiz (1.6 mg/kg) inhibited the growth of earthworms. Their toxicity to lysosomal membranes increased with exposure concentration and time. The effect of imidaclothiz on the weight (7 d) and lysosomal membranes (2 d) of earthworms was significantly higher than that of imidacloprid and thiacloprid at the same concentrations. However, the neutral red retention time was more sensitive than the weight loss and more suitable for monitoring the impact of low-dose pollutants on the growth of non-target organisms.

neonicotinoid; weight loss; lysosomal membrane; neutral red retention time; earthworm

2014-05-04

2014-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171878，31272079)

S 482.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.007

* 通信作者 E-mail:hyjiang6281@gmail.com