超高效合相色譜/二極管陣列檢測器測定螺旋藻保健食品中的類胡蘿卜素

李 兵，趙海燕*，劉 偉，范 賽，李麗萍，吳國華，薛 穎，趙 榕

(1．北京市疾病預防控制中心 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生所，北京 100013;2．北京市疾病預防控制中心科研教學管理辦公室，北京 100013)

類胡蘿卜素是一類天然存在的脂溶性色素，普遍存在于藻類、植物、真菌和細菌中。人和動物不能合成類胡蘿卜素，均需通過食物獲?。?－2］。近年來，大量流行病學調查顯示，攝入富含類胡蘿卜素的食物可以降低罹患許多慢性病的風險［3－8］。玉米黃質和葉黃素具有預防光損傷和防治老年性黃斑衰退癥的功能［9］。β-胡蘿卜素是一種重要的維生素A來源，通過攝入β-胡蘿卜素可以有效的對維生素A進行補充［10］。因此明確食物中類胡蘿卜素的含量對于探討膳食和健康之間的特異性聯(lián)系有重要意義。螺旋藻營養(yǎng)價值豐富，世界上很多地方將其列為保健食品，準確測定其類胡蘿卜素含量，對于正確評價螺旋藻保健食品的營養(yǎng)價值，開展營養(yǎng)學研究十分必要。

植物中類胡蘿卜素的檢測方法有高效液相色譜法［11－12］、液相色譜 － 串聯(lián)質譜法［13］、超臨界流體色譜法［14－15］。由于類胡蘿卜素的同分異構體較多，如玉米黃質和葉黃素的分子量完全相同，分子結構只有雙鍵位置的差異(見圖1)，高效液相色譜法中較常用的C18色譜柱難以將其分離。C30色譜柱可以對二者進行分離，但需使用大量二氯甲烷、三氯甲烷等對人體危害較大的溶劑，且分析時間較長［16］。液相色譜－串聯(lián)質譜法由于類胡蘿卜素同位素內標較難獲得，因此定量分析較為困難。超臨界流體色譜(Supercritical fluid chromatography，SFC)是一種分離度高、綠色環(huán)保的分離儀器，以超臨界CO2作流動相，具有接近于氣體的低粘度和高擴散系數，在相同的時間內，可獲得比液相色譜更高的分離度和更尖銳的峰形。目前SFC測定類胡蘿卜素的報道多關注于色譜分離結果的分析與討論，定量分析方法較少［14－15］。Abrahamsson等［14］采用SFC對柵藻中的類胡蘿卜素進行了測定，并將2根5 μm粒徑的C18和2－EP色譜柱串聯(lián)使用，以獲得良好的分離效果，然而色譜柱的增加也同時造成分析時間的延長和系統(tǒng)壓力的增加。

超高效合相色譜(Ultraperformance convergence chromatography，UPC2)或超高效超臨界流體色譜(Ultra high performance SFC，UHPSFC)［17］集SFC和UPLC的優(yōu)點于一體，色譜柱采用亞2 μm的填料，與傳統(tǒng)的5 μm色譜柱相比，粒徑減小使得色譜柱理論塔板高度減小，更有利于分離［18－19］。目前尚無將UPC2應用于螺旋藻保健食品中類胡蘿卜素測定的報道。本研究建立了超高效合相色譜測定螺旋藻保健食品中β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素的方法。此方法可用于日常樣品的定量檢測，具有操作簡便、快速、靈敏度高等特點。

圖1 β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素的分子結構Fig.1 Molecular structures of β-carotene，zeaxanthin and lutein

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPC2系統(tǒng)(美國Waters公司)，配ACQUITY UPC2PDA檢測器;ACQUITY UPC2HSS C18SB色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm，美國Waters公司);紫外－可見光分光光度計(日本島津公司);離心機(美國Beckman公司);超聲波清洗器(上?？茖Ч?;FA2004電子天平(感量:0.000 1 g，上海天平儀器廠);0.2 μm GHP有機過濾膜(美國Waters公司)。

甲醇、乙醇、異丙醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司);二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、正己烷、二甲亞砜(色譜純，美國Dikma公司);β-胡蘿卜素(25 mg TypeⅡ，Synthetic，≥95%，美國Sigma公司)，玉米黃質(25 mg，95.5%，美國ChromaDex公司)，葉黃素(25 mg，91.5%，美國ChromaDex公司)，氫氧化鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，2，6-二叔丁基對甲酚(BHT，≥99.0%，美國Sigma公司)。

1.2 標準儲備液制備

標準儲備液配制:稱取β-胡蘿卜素標準品0.019 8 g，以二氯甲烷溶解，定容至100.0 mL棕色容量瓶中。稱取玉米黃質標準品0.018 0 g、葉黃素標準品0.015 0 g用乙醇溶解，轉移并定容至100.0 mL棕色容量瓶。3種類胡蘿卜素標準儲備液使用前均需校正。

標準溶液濃度的校正［20－21］:吸取0.10 mL β-胡蘿卜素標準儲備液至棕色容量瓶，用正己烷定容至10.0 mL，用分光光度計在453 nm校正波長下測得比吸光系數為2 592;分別吸取0.10 mL玉米黃質和葉黃素標準儲備液至棕色容量瓶，用無水乙醇定容至10.0 mL，玉米黃質在450 nm校正波長下測得比吸光系數為2 540;葉黃素在445 nm校正波長下測得比吸光系數2 550。以公式C=A×10 000/計算其實際濃度(見表1)。

表1 類胡蘿卜素標準儲備液濃度Table 1 Concentrations of the carotenoids standard stock solutions

1.3 樣品前處理

稱取0.50 g樣品置于50 mL離心管中，依次加入0.1 g BHT以及15.0 mL二氯甲烷－乙醇溶液(2∶1)，充入氮氣排出空氣后蓋上蓋子，10℃超聲提取15 min后，在10 000 r/min條件下離心10 min，轉移上層清液至50.0 mL棕色容量瓶中，重復提取2次，合并提取液并定容至50.0 mL，過0.2 μm GHP濾膜后直接上機測定，實驗全程避光。

1.4 儀器分析條件

色譜柱:ACQUITY UPC2HSS C18SB柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm);流動相:二氧化碳(A)－甲醇(B);梯度洗脫程序:0～7 min，90%～75%A;7～8 min，75%A;8～8.5 min，90%A。流速:1.0 mL/min。柱溫40℃;進樣量為1 μL;系統(tǒng)背壓2 000 psi。β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質的檢測波長分別為436，432，438 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

采用CO2－甲醇流動相體系考察了4根Waters UPC2色譜柱對3種類胡蘿卜素分離的影響，包括ACQUITY UPC2BEH色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.7 μm，未鍵合型)，ACQUITY UPC2BEH 2－EP色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.7 μm，2-乙基吡啶鍵合相，未封端)，ACQUITY UPC2CSH Fluoro－Phenyl Column色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.7 μm，氟苯基鍵合相，未封端)以及ACQUITY UPC2HSS C18SB色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm，C18鍵合相，未封端)，結果見圖2。從圖中可以看出不同色譜柱對于3種類胡蘿卜素的保留情況不同。但基本類似正相色譜的選擇性，即極性較弱的β-胡蘿卜素最先流出，極性強的葉黃素和玉米黃質較晚出峰。從BEH柱的色譜圖可以看出，由于不帶任何鍵合相的BEH色譜柱與極性基團的相互作用較強，因此能夠初步分離極性稍強的葉黃素和玉米黃質，但由于非極性的β-胡蘿卜素保留較弱，出峰較早，容易受到干擾;BEH 2－EP色譜柱對非極性的β-胡蘿卜素保留也較弱，葉黃素和玉米黃質的峰形較差;CSH色譜柱的鍵合相是氟苯基，其對β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質的保留均較弱，且3個組分的出峰時間短，從而造成分離度較差，葉黃素與玉米黃質二者不能很好分離。HSS C18SB色譜柱對3種類胡蘿卜素的分離度高，峰形良好?？赡苁且驗镠SS C18SB色譜柱的C18鍵合相對這3種物質有很好的保留作用。由于CO2對于非極性的β-胡蘿卜素溶解能力較強，因此首先被洗脫出，之后隨著流動相中甲醇含量的增加，葉黃素和玉米黃質被洗脫下來。HSS C18SB色譜柱可以滿足樣品中3種類胡蘿卜素的測定要求。因此實驗選擇ACQUITY UPC2HSS C18SB色譜柱。

2.2 助溶劑的選擇

超臨界CO2具有較強的非極性，通過添加助溶劑，改變流動相極性，可以實現不同極性目標物的洗脫。本研究考察了甲醇、乙醇、異丙醇作為助溶劑對3種類胡蘿卜素的分離情況。實驗結果表明，3種醇均能實現3種類胡蘿卜素的有效分離。對于非極性較強的β-胡蘿卜素，3種溶劑的洗脫能力相差不大。對于極性稍強的葉黃素和玉米黃質，隨著異丙醇、乙醇、甲醇極性的遞增，洗脫能力增強。因此，使用甲醇為助溶劑可以縮短分析時間，且峰形更加尖銳。因此實驗選擇甲醇為助溶劑。

圖2 β-胡蘿卜素(1)、葉黃素(2)和玉米黃質(3)在4種色譜柱上的色譜圖Fig.2 Chromatograms of β-carotene(1)，lutein(2)and zeaxanthin(3)on 4 different columns

2.3 系統(tǒng)背壓及溫度的選擇

UPC2主要采用超臨界狀態(tài)的CO2作流動相，流動相密度的增大可提高其對物質的溶解能力。系統(tǒng)背壓和溫度的改變均可改變流動相的密度，從而改變其洗脫能力和選擇性。因此本實驗考察了不同的系統(tǒng)背壓(1 700，1 900，2 000，2 100 psi)對分離的影響。結果表明，隨著背壓的增大，3種化合物的洗脫能力均增強，這是由于隨著超臨界狀態(tài)CO2密度的增大，其對類胡蘿卜素的溶解能力逐漸增強，但對這3種類胡蘿卜素的分離和峰形影響不大。較大的系統(tǒng)背壓雖可以縮短分析時間，但同時也會增大系統(tǒng)壓力，影響色譜柱和儀器的壽命。為了兼顧分析時間和系統(tǒng)壓力，本研究選擇系統(tǒng)背壓為2 000 psi。進一步考察了不同柱溫(35，40，50℃)對分離的影響，結果顯示，不同溫度對于類胡蘿卜素分離的差異不大，但由于類胡蘿卜素受熱易分解，需要盡量選擇較低的溫度。綜合考慮峰形和保留時間，選擇柱溫為40℃。

圖3 β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質的UPC2光譜圖Fig.3 UPC2spectra of β-carotene，lutein and zeaxanthin

2.4 檢測波長的選擇

采用3D檢測模式，對胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質標準品進行掃描(見圖3)。選擇436，432，438 nm為最佳吸收波長。

2.5 UPC2與UPLC分離效果的比較

Bijttebier等［22］使用 ACQUITY UPLC HSS C18SB(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱對類胡蘿卜素進行了分離，采用較為復雜的流動相體系，A為5 mmol/L乙酸銨水溶液－甲醇－乙腈－乙酸乙酯(50∶22.5∶22.5∶5)，B為乙腈－乙酸乙酯(50∶50)，此方法對玉米黃質和葉黃素的分離較差。而本研究采用UPC2測定時二者實現了完全分離，且只需10 min即可完成樣品的分析。而UPLC分析時間較長，需要17 min才能使3種類胡蘿卜素完全流出。雖然UPLC和UPC2使用的色譜柱填料和粒徑較為相似，但UPC2的分離效率更高，分析時間更短。

2.6 提取溶劑的選擇

自然界中很多植物均富含類胡蘿卜素，由于類胡蘿卜素的種類繁多，從葉黃素到胡蘿卜素的極性差異較大。不同植物組織結構不同，類胡蘿卜素的含量也不盡相同，因此現在并沒有一種公認的適用于任何植物中所有類胡蘿卜素的提取方法。對于β-胡蘿卜素等非極性類胡蘿卜素，較常用的提取溶劑有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、四氫呋喃等;對于葉黃素等極性類胡蘿卜素，提取溶劑為乙醇、丙酮、甲醇、異丙醇等。為兼顧不同極性類胡蘿卜素的提取效率，本研究選擇混合溶劑提取，并對比了不同溶劑的提取效率。與Yu等［23］的報道相同，本實驗發(fā)現所測樣品不含葉黃素，因此葉黃素采用加標的方法進行溶劑的選取。分別稱取0.50 g樣品，均加入143 μg/mL葉黃素標準溶液1.00 mL，其余方法同“1.3”。分別考察了丙酮、四氫呋喃、丙酮－正己烷(2∶8)、二甲亞砜－二氯甲烷－乙醇(1∶1∶2)、乙醇－正己烷(4∶3)、正己烷－丙酮(1∶1)、二氯甲烷－乙醇(2∶1)以及丙酮－乙醇(1∶1)對β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素3種類胡蘿卜素的提取效果，結果見圖4。結果表明，二氯甲烷－乙醇(2∶1)的提取效率最高。因此本文采用二氯甲烷－乙醇(2∶1)作為提取溶劑。

圖4 不同混合溶劑對類胡蘿卜素的提取結果Fig.4 Extraction amount of carotenoid in different mixture solventsA．acetone，B．THF，C．acetone－h(huán)exane(2∶8)，D．DMSO－DCM－ethanol(1∶1∶2)，E．ethanol－h(huán)exane(4 ∶3)，F．hexane－acetone(1∶1)，G．DCM－ethanol(2∶1)，H．acetone－ethanol(1∶1)

2.7 方法驗證實驗

2.7.1 標準曲線、檢出限與定量下限 準確吸取β-胡蘿卜素標準儲備液，配成濃度為1.12，1.87，3.74，7.48，14.96，18.70 μg/mL標準系列;準確吸取玉米黃質標準儲備液配成濃度為0.835，1.67，3.34，6.68，13.36，16.70 μg/mL標準系列;準確吸取葉黃素標準儲備液配成濃度為1.29，1.43，5.72，8.58，11.44，14.30 μg/mL標準系列。以標準系列溶液的峰面積(Y)對相應濃度(X，μg/mL)建立線性回歸方程，各組分在線性范圍內的峰面積與濃度呈良好線性關系，相關系數均不低于0.999 3。通過逐級稀釋樣品溶液，按信噪比S/N=3和S/N=10分別計算分析方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到方法的LOD為0.012～0.035 mg/g，LOQ為0.040～0.120 mg/g(見表2)。

表2 3種類胡蘿卜素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限與定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection and limits of quantitation of three carotenoids

2.7.2 回收率與精密度 分別向樣品中添加3種成分的標準品，設置低、中、高3個加標水平，按照“1.3”方法處理后上機測定，每個加標水平重復測定6次，并計算其加標回收率和相對標準偏差(RSD)。結果如表3所示，β-胡蘿卜素、玉米黃質與葉黃素的平均回收率為82.5%～95.7%，RSD為7.6%～9.8%，可以滿足測定需要。

表3 樣品中3種類胡蘿卜素的含量及其加標回收率(n=6)Table 3 Contents and spiked recoveries of three cartenoids in samples(n=6)

2.8 實際樣品的測定

應用上述方法，對市售的10種螺旋藻保健食品進行測定，結果測得β-胡蘿卜素含量為230～1 160 μg/g，玉米黃質含量為102～584 μg/g，均未檢出葉黃素。

3 結論

本文建立了超高效合相色譜測定螺旋藻保健食品中β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素的分析方法。通過對色譜柱、助溶劑、柱溫和背壓的優(yōu)化，在10 min內實現了3種類胡蘿卜素的有效分離。與傳統(tǒng)的液相色譜方法相比，極大地縮短了分析時間。且采用CO2和少量甲醇為流動相，減少了有機溶劑的使用。本方法綠色環(huán)保、環(huán)境友好、簡便、快速，可應用于實際樣品的測定。

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