陳立 馮學(xué)泉 萬晨光 左娜 穆紅

目前，針對腦死亡供體（donation after brain death，DBD）器官的保護(hù)效果不甚理想，即使在西方發(fā)達(dá)國家，仍有約25%的潛在DBD器官在維護(hù)過程中逐漸失去功能。研究［1，2］表明腦死亡過程可誘導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而對潛在供體器官的質(zhì)量造成損傷。因此，為提高DBD器官質(zhì)量，有必要就腦死亡過程急性炎癥反應(yīng)進(jìn)行深入探討。白細(xì)胞介素－8（interleukin－8，IL－8）亦稱為嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，為公認(rèn)的介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子。其來源可以是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等，生物學(xué)作用不但能趨化嗜中性粒細(xì)胞，而且趨化T淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，在殺傷病原微生物的同時也會對自身組織細(xì)胞造成損傷。

本文通過對實(shí)驗(yàn)長白小豬的腦死亡模型時間序列IL－8的水平檢測研究，進(jìn)一步為DBD器官抗炎損傷的保護(hù)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康、清潔級長白小豬7頭，體質(zhì)量（33.6±4.7）kg，雌雄不限，購自天津市動物實(shí)驗(yàn)中心。術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。

1.2 主要設(shè)備 美國強(qiáng)生Codmen顱內(nèi)壓監(jiān)測儀；以色列RIMED公司經(jīng)顱多普勒（transcranial doppler，TCD）； 美國BIOPAC公司MP150型 16通道生理信號記錄分析系統(tǒng)；美國HARVARD動物手術(shù)臺；美國Matrx model 3000型動物麻醉機(jī)；深圳Beneview T8麻醉監(jiān)護(hù)儀；美國Cobas DDP全自動生化分析儀。

1.3 腦死亡模型建立 取豬稱重，麻醉后備皮，股動、靜脈插管，分別接壓力傳感器（描記動脈壓）和靜脈通道；氣管插管接微型呼吸器并監(jiān)測呼吸波；連接心、腦電圖電極監(jiān)測心、腦電圖；膀胱造瘺；顱頂正中開孔經(jīng)導(dǎo)管漸進(jìn)式注入生理鹽水，直至達(dá)到腦死亡標(biāo)準(zhǔn)。靜脈滴注多巴胺≤10μg／kg·min維持循環(huán)，觀察心電圖、血壓及血?dú)獾淖兓?/p>

腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)及顱內(nèi)加壓停止標(biāo)準(zhǔn)參考我國2009年頒布的《腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)（成人）》［3］，擬定腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）瞳孔對光反射消失；（2）角膜反射消失；（3）刺激豬頭面部，實(shí)驗(yàn)豬無反應(yīng)；（4）無自主呼吸；（5）經(jīng)TCD顯示振蕩波、尖小收縮波或血流信號消失；（6）腦電圖顯示電靜息；（7）阿托品試驗(yàn)陰性。首次判定12 h后再次復(fù)查，結(jié)果仍符合腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)者，方可最終確認(rèn)為腦死亡。

1.4 頸內(nèi)靜脈取血時間點(diǎn)及處理 麻醉、插管、放置探頭等處理后，分別在顱內(nèi)加壓前、腦死亡0 h、腦死亡3 h、腦死亡6 h、腦死亡9 h各時間點(diǎn)取靜脈血5 ml，室溫靜置 1－2 h 后，以離心半徑 15 cm，3000 r／min離心10 min分離血清，置于－80℃保存待測。

1.5 IL－8及腎功能指標(biāo)檢測 采用免疫芯片熒光定量法檢測血清IL－8水平，試劑由廣州RayBiotech公司提供。采用美國Cobas DDP全自動生化分析儀及其配套試劑檢測血清尿素、肌酐（creatinine，Cr）水平。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。IL－8 檢測結(jié)果采用 M（P25～P75）表示，腦死亡后各時間點(diǎn)與腦死亡前IL－8檢測結(jié)果比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)，腦死亡后各時間點(diǎn)IL－8檢測結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)；腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果以±s表示，腦死亡后各時間點(diǎn)與腦死亡前腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；IL－8各時間點(diǎn)檢測結(jié)果與腎功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用雙側(cè)Spearman相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦死亡前后各時間點(diǎn) IL－8檢測結(jié)果比較腦死亡后 IL－8 檢測結(jié)果開始升高，3 h、6 h、9 h 的IL－8檢測結(jié)果均高于腦死亡前，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。腦死亡后各時間點(diǎn) IL－8 的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H＝7.840，P＝0.098），見表1，圖1。

表1 腦死亡前后各時間點(diǎn)IL－8檢測結(jié)果比較［M（P25～P75），pg／mL］

2.2 腦死亡前后各時間點(diǎn)尿素、Cr檢測結(jié)果比較腦死亡后3 h、6 h、9 h的尿素檢測結(jié)果均高于腦死亡前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。腦死亡后6 h、9 h的Cr檢測結(jié)果均高于腦死亡前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2，圖2、3。

2.3 腦死亡后血清IL－8水平與腎臟功能指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果 腦死亡后血清IL－8與尿素檢測結(jié)果呈正相關(guān)性（r＝0.453，P＝0.012），與Cr檢測結(jié)果無相關(guān)性（r＝0.209，P＝0.267）。

圖1 腦死亡前后各時間點(diǎn)IL－8檢測結(jié)果

圖2 腦死亡前后各時間點(diǎn)血清尿素檢測結(jié)果

圖3 腦死亡前后各時間點(diǎn)血清Cr檢測結(jié)果

3 討論

表2 腦死亡前后各時間點(diǎn)尿素、Cr檢測結(jié)果比較（±s）

表2 腦死亡前后各時間點(diǎn)尿素、Cr檢測結(jié)果比較（±s）

注：＊與腦死亡前比較，P＜0.05

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腦死亡是一個復(fù)雜的病理生理過程。近年的研究［2］結(jié)果顯示，腦死亡可造成血流動力學(xué)的劇烈改變、交感神經(jīng)系統(tǒng)的改變、內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝的改變，激活諸多細(xì)胞因子，引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂、激素濃度的改變、內(nèi)分泌代謝的顯著變化以及炎性和免疫反應(yīng)的激活，從而導(dǎo)致潛在腦死亡供體器官的損傷。因此，腦死亡過程可誘導(dǎo)多種促炎癥因子的釋放并能激活細(xì)胞因子間的級聯(lián)反應(yīng)。IL－8為1987年Yoshimura 發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為（8～10）×103的多肽，是機(jī)體的重要炎性反應(yīng)細(xì)胞因子之一。主要作用可誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞形態(tài)改變并驅(qū)化炎性反應(yīng)，同時引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高、顆粒內(nèi)含物釋放、黏附蛋白上調(diào)，生物活性脂質(zhì)形成和呼吸爆發(fā)，釋放超氧化物和溶酶體酶，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷［2，4］。

本文研究結(jié)果顯示，長白小豬腦死亡0 h時血清IL－8濃度較腦死亡前有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腦死亡 3 h 時 IL－8 檢測水平較腦死亡前水平明顯升高，腦死亡6 h時IL－8水平達(dá)高峰，之后逐漸下降，上述研究結(jié)果提示IL－8升高為腦損傷及腦死亡發(fā)生時的應(yīng)激反應(yīng)，與相關(guān)報(bào)道［4］IL－8的反應(yīng)強(qiáng)度與腦損傷程度及腦死亡進(jìn)程有關(guān)相一致。但本文研究結(jié)果顯示，腦死亡后各時間點(diǎn)IL－8的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測與本文研究中長白小豬腦死亡模型的形成過程緩慢而平穩(wěn)，并非急性腦損傷導(dǎo)致的腦死亡有關(guān)。而IL－8檢測結(jié)果出現(xiàn)先升高后降低趨勢，推測與隨著時間推移，應(yīng)激反應(yīng)減弱以及IL－8半衰期較短導(dǎo)致其濃度達(dá)到高峰后逐漸衰減有關(guān)。因此，為保護(hù)DBD器官，應(yīng)盡可能早地，至少在腦死亡后6 h即IL－8達(dá)到高峰之前采取干預(yù)措施，以有效降低腦死亡進(jìn)程中IL－8所致的炎性器官損傷。腎功能指標(biāo)尿素升高與IL－8同步，Cr稍有滯后，且Cr濃度在腦死亡后3 h內(nèi)出現(xiàn)輕度下降，之后逐漸升高，可能由于抗利尿激素急劇下降、腎灌注尚可而形成的暫時性腎小球?yàn)V過相對增強(qiáng)所致［4］。但尿素與Cr在腦死亡3 h后均隨時間推移表現(xiàn)出不可逆的上升趨勢，與IL－8在腦死亡9 h 之后檢測結(jié)果逐漸下降不同。據(jù)報(bào)道［5，6］，腦死亡后光鏡下可見腎小管內(nèi)有均質(zhì)狀粉染物，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，界限不清，管腔狹窄閉塞，部分可見炎癥細(xì)胞浸潤，少數(shù)腎小管細(xì)胞壞死。說明腦死亡早期，腎臟組織即可出現(xiàn)明顯的病理生理改變。本文研究將IL－8檢測水平與腎功能指標(biāo)具體檢測數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，IL－8水平與尿素的變化呈正相關(guān)，而與Cr的變化無相關(guān)性，從而進(jìn)一步證實(shí)了腦死亡早期升高的IL－8因子可造成組織器官局部嗜中性粒細(xì)胞聚集并首先攻擊腎小管，引起腎小管的炎性損傷，但其對腎小球損傷相對較輕，尿素升高的原因可能是IL－8的升高激活嗜中性粒細(xì)胞對組織細(xì)胞的損傷，組織細(xì)胞壞死及凋亡后出現(xiàn)的蛋白質(zhì)降解造成尿素來源的增高，最終導(dǎo)致血液尿素濃度的升高［7，8］。

綜上所述，腦死亡可引起機(jī)體大量釋放IL－8，并可導(dǎo)致組織器官的不可逆性損傷。因此，臨床為保護(hù)潛在移植器官應(yīng)在腦死亡確立以后及時采取有效的血液凈化吸附IL－8，以盡可能降低組織器官的炎性損傷。

1 Auraen H，Mollnes TE，Bjortuft O，etal.Multiorgan procurement increases systemic inflammation in brain dead donors.Clin Transplant，2013，27：613－618.

2 Ranasinghe AM，Bonser RS.Endocrine changes in brain death and transplantation.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011，25：799－812.

3 衛(wèi)生部腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)起草小組.腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)（成人）（修訂稿）.中國腦血管病雜志，2009，6：220－224.

4 Rech TH，Moraes RB，Crispim D，etal.Management of the braindead organ donor：a systematic review and meta-analysis.Transplantation，2013，95：966－974.

5 Floerchinger B，Oberhuber R，Tullius SG.Effects of brain death on organ quality and transplant outcome.Transplant Rev（Orlando），2012，26：54－59.

6 Oltean S，Pullerits R，F(xiàn)lodén A，etal.Increased resistin in brain dead organ donorsisassociated with delayed graft function after kidney transplantation.JTransl Med，2013，11：233.

7 Watts RP，Thom O，F(xiàn)raser JF.Inflammatory signallingassociated with brain dead organ donation：from brain injury to brain stem death and posttransplant ischaemia reperfusion injury.J Transplant，2013，52：1369.

8 Zhao G，Shen X，Nan H，etal.Remifentanil protects liver against ischemia／reperfusion injury through activation of anti－apoptotic pathways.JSurg Res，2013，183：827－834.