石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全
(遼寧省醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院 121001)
豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用
石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全*
(遼寧省醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院 121001)
為了建立豬水皰病RT-PCR檢測(cè)方法并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)。根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬水皰病16SrRNA基因序列,設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法研究。結(jié)果表明,能夠擴(kuò)增的基因片段大小為687bp,與GenBank收錄的相關(guān)序列同源性高達(dá)93.2%,對(duì)62份樣品進(jìn)行了檢測(cè),陽性率為22.58%。
豬水皰病;RT-PCR;建立;應(yīng)用
豬水皰病 (Swinevesiculardisease,SVD)病原是豬水皰病病毒(SVDV)為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。豬水皰病是豬的一種急性傳染病,其臨床表現(xiàn)以口鼻腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水皰或潰爛為特征。目前,常用的SVDV實(shí)驗(yàn)室診斷方法無法快速準(zhǔn)確的對(duì)該病進(jìn)行確診,以致錯(cuò)過最佳的預(yù)防治療時(shí)機(jī),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過建立SVDV反轉(zhuǎn)錄-巢式PCR(RT-nPCR)方法,開展對(duì)SVD的快速診斷研究,為豬水皰病的防治奠定基礎(chǔ)。
采自遼寧省錦州地區(qū)養(yǎng)豬戶或養(yǎng)豬場(chǎng)水皰性疾病的水皰液或水皰皮62份;對(duì)照毒株為口蹄疫病毒、水皰性口炎均由遼寧醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存,豬水皰性疹病毒基因片段質(zhì)粒由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)。
全血基因組RNA提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,質(zhì)粒小量制備試劑盒、DH5α 感受態(tài)菌和 pMDl8-TVector、TakaraExTaq聚合酶等均購于大連寶生物公司、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD公司);PCA300型電泳儀(Bio-RAD公司)。
根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬SVDV VP1基因序列,利用分子生物學(xué)軟件對(duì)序列比對(duì)分析后,利用Primer5.0設(shè)計(jì)出下列引物,設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物,能夠擴(kuò)增出681bp基因片段:
外引物:P1-GACTCCGATGGCGACAACTT;P2-TTGCTTGTCAAACCT GGC。
內(nèi)引物:P3-ACTTGGGAGCGGAC CAGTTA;P4-GAGCAACTTGCCGTGTGT。
按照提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
通過試驗(yàn),建立并優(yōu)化RT-nPCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系為:
總 體 系 為 25μl: 模 板 1μl,2.5mmol/LdNTP2μl, 50pmol/L 的 P1和 P2各 0.2μl, 100pmol/L的 P3和 P4各 3μl, 10xPCRbuffer2.5μl, ExTaq 聚合酶 1μl, ddH2O13.6μl。
反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min;94℃變性 45s; 58℃退火 45s, 72℃延伸45s, 5個(gè)循環(huán); 94℃, 5min; 94℃變性20s; 54℃退火 30s, 72℃延伸 30s, 30個(gè)循環(huán);72℃,5min。
外引物最佳退火溫度確定:在其他反應(yīng)條件不變,對(duì)第一輪PCR的退火溫度進(jìn)行溫度梯度PCR,退火溫度范圍為56~70℃;外引物最佳退火溫度確定:在確定外引物最佳退火溫度后,使用內(nèi)引物進(jìn)行溫度梯度PCR,退火溫度范圍為51~55℃,其他反應(yīng)條件不變。內(nèi)外引物的最佳退火溫度均根據(jù)目的條帶的亮度確定。
在PCR之后,在1%瓊脂糖凝膠中電泳進(jìn)行檢測(cè),將目的條帶使用膠回收試劑盒回收,與pMD18-T載體于4℃連接過夜后,然后轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸埃希菌DH5α,挑取具有氨芐抗性的陽性克隆,提取質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序。
分別提取口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉(zhuǎn)錄DNA作為模版,稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度,按l.5所述的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。
提取陽性豬水皰病病毒反轉(zhuǎn)錄DNA,測(cè)定其OD值,計(jì)算出DNA濃度,然后進(jìn)行10倍倍比稀釋后,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。
應(yīng)用建立的檢測(cè)方法對(duì)來自錦州地區(qū)62份樣本進(jìn)行檢測(cè)。
測(cè)序結(jié)果表明,獲得基因片段的大小為681bp。同Genbank中所列相關(guān)基因進(jìn)行比較,基因同源性在93.2%。圖1為可樣品檢測(cè)結(jié)果。
圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖2表明,使用外引物P1、P2時(shí),退火溫度在59℃目的條帶最亮,因此確定最佳外引物退火溫度為59℃;圖3表明,退火溫度在52℃時(shí)條帶最亮,所以確定最佳內(nèi)引物退火溫度為52℃。
圖2 外引物溫度梯度PCR結(jié)果
結(jié)果顯示,以SVDV陽性全血作為模板進(jìn)行RT-nPCR反應(yīng)可以擴(kuò)增得到大小為687bp的特異性條帶,而以口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉(zhuǎn)錄DNA作為模版則均未見特異性條帶。
圖3 內(nèi)引物溫度梯度PCR結(jié)果
結(jié)果顯示,當(dāng)樣本反轉(zhuǎn)錄基因組DNA稀釋到105倍時(shí)RT-PCR還能見到清晰的條帶,說明該豬水皰病RTPCR方法有較高的敏感性。
應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法對(duì)來自錦州地區(qū)62份樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果檢測(cè)出陽性樣本14例,陽性率22.58%。
2013年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目:豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用(201310160025)。
石鑫(1991-),女,遼寧省海城市人,本科學(xué)生,動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)。