藍(lán)金紅 陶立 李軍 閉炳芬 黃明學(xué) 藍(lán)顯利 胡萍 馬春霞農(nóng)啟文 陳澤祥 楊威 韋志鋒 蘭美益 秦若甫

（1，廣西壯族自治區(qū)馬山縣動物疫病預(yù)防控制中心 530600;2，廣西獸醫(yī)研究所 530001;3，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

馬山黑山羊主要疫病病原調(diào)查

藍(lán)金紅1陶立2,3李軍2,3閉炳芬2,3黃明學(xué)1藍(lán)顯利1胡萍1馬春霞2,3農(nóng)啟文1陳澤祥2,3楊威2,3韋志鋒2,3蘭美益2,3秦若甫2,3

（1，廣西壯族自治區(qū)馬山縣動物疫病預(yù)防控制中心 530600;2，廣西獸醫(yī)研究所 530001;3，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

為了掌握馬山黑山羊主要疫病病原種類，本研究采用現(xiàn)場調(diào)查、病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、生化特性鑒定、生長抑制試驗(yàn)、PCR鑒定、動物致病性試驗(yàn)和蠕蟲學(xué)剖解等方法對2013～2014年81例馬山黑山羊病例進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，細(xì)菌感染的病例59例，病毒感染的病例8例，寄生蟲病12例，中毒病2例，主要病原為綿羊肺炎支原體、大腸桿菌、染性膿皰病毒。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的細(xì)菌只對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星敏感;而支原體則對壯觀霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考高度敏感。本研究結(jié)果對馬山黑山羊疫病防控具有一定的指導(dǎo)意義。

黑山羊;疫病;綿羊肺炎支原體;調(diào)查

馬山縣位于廣西中南部，地處紅水河南岸，大明山北麓，山多林密，當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)的黑山羊因全身黑毛，生長發(fā)育快，板肉厚滿，皮毛質(zhì)軟細(xì)小，瘦肉率高，肉質(zhì)鮮嫩，味美膻氣少，香甜可口，營養(yǎng)價值高等獨(dú)特之處，在中國東南沿海一帶及港澳臺地區(qū)享有較高聲譽(yù)，是專供香港的優(yōu)質(zhì)山羊品種。2000年以來，在政府的大力推動下，馬山黑山羊養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展，但是，隨著飼養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖方式的轉(zhuǎn)變以及養(yǎng)殖戶缺乏疫病防控知識，黑山羊疫病的發(fā)生逐年增多，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了黑山羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1,2]。為此，我們于2013～2014年對馬山黑山羊開展疫病調(diào)查，摸清疫病種類，以期為其防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

檢測樣本采集自81個病例的羊肺、肝、腎、淋巴結(jié)、痘疹結(jié)節(jié)、痂皮、胸腔積液、膿汁、小腸內(nèi)容物、直腸糞便或糞便拭子等。

1.1.2 試驗(yàn)動物

未免疫過羊支原體疫苗的15kg左右黑山羊購自馬山縣個體養(yǎng)殖戶；20g左右昆明種小白鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 試劑和儀器

PPLO肉湯購自杭州百思生物技術(shù)有限公司。馬血清購自廣東蕊特生物科技有限公司。TSA瓊脂和TSB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂和TSI瓊脂購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；馬丁湯、兔血瓊脂培養(yǎng)基為廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌室制。衣原體微量血清診斷試劑盒、綿羊肺炎支原體Y98型凍干陽性血清和絲狀支原體山羊亞種PG3型凍干陽性血清購自蘭州獸醫(yī)研究所。大腸桿菌血清定型試劑盒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。細(xì)菌微量生化鑒定管和藥敏試紙片購自杭州天和生物技術(shù)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒、PCRTaqMix等分子生物學(xué)試劑購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR儀購自日本TaKaRa公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國AlphaInotech公司。

1.2 方法

1.2.1 支原體的分離和鑒定

無菌取病羊肺組織1小塊，加5ml培養(yǎng)液勻漿，4000r/min離心15min，取適量肺組織上清液或胸腔積液接種到含20%馬血清PPLO肉湯培養(yǎng)基中，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，并盲傳2～3代，發(fā)現(xiàn)24h后才開始變黃且液體透亮的培養(yǎng)物，經(jīng)0.45μm細(xì)菌濾器過濾后，按10%（v/v）的接種量將濾液加入到含20%馬血清PPLO肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)傳1～2代，若傳代培養(yǎng)基仍然變黃，可在PPLO固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)，倒置于顯微鏡上，在40×光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的生長和形態(tài)。挑取單個菌落涂于載玻片上，火焰固定，分別作革蘭氏和姬姆薩-瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其染色形態(tài)。按陶立等（2012）和儲岳峰等（2009）方法進(jìn)行支原體的生長抑制試驗(yàn)和PCR鑒定[3,4]。

1.2.2 細(xì)菌的分離和鑒定

取病變組織分別接種TSA瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、TSI瓊脂培養(yǎng)基、馬丁湯和兔血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個菌落涂于載玻片上，火焰固定，革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色形態(tài)。按陳澤祥等（2008）方法進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增和鑒定[5]。PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將純化的分離菌接種微量生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)48h進(jìn)行細(xì)菌的生化特性測定。應(yīng)用大腸桿菌血清定型試劑盒對分離的致病性大腸桿菌進(jìn)行O抗原血清分型。

1.2.3 病毒的檢測

將采集的病羊痘疹結(jié)節(jié)或痂皮用加有雙抗的生理鹽水研磨，反復(fù)凍融3次，4000r/min離心10min，取上清液，應(yīng)用病毒基因組提取試劑盒提取病毒基因組DNA或RNA，按劉棋等（2006）和向智龍等（2010）方法進(jìn)行山羊痘病毒和羊口瘡病毒的PCR檢測[6,7]。

1.2.4 衣原體檢測

由于馬山黑山羊均未免疫衣原體疫苗，因此采用血清學(xué)檢測方法來判斷病羊是否感染衣原體，檢測方法和判定標(biāo)準(zhǔn)按說明書進(jìn)行。

1.2.5 寄生蟲和中毒檢測

按蠕蟲學(xué)剖解的方法檢查和觀察病羊?qū)嵸|(zhì)臟器中寄生蟲的蟲體；采用沉淀法和飽和鹽水或糖水漂浮法檢查糞便中蟲體、蟲卵或卵囊的形態(tài)。按現(xiàn)場調(diào)查，癥狀以及治療的結(jié)果進(jìn)行是否中毒的診斷。

1.2.6 分離病原菌的致病性試驗(yàn)

將4ml支原體純培養(yǎng)物（3×108CFU/ml)氣管接種于黑山羊，觀察和記錄黑山羊的臨床變化情況，30d后剖解試驗(yàn)羊。將純化的分離菌接種小白鼠，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔接種0.3ml菌懸液，對照組小白鼠腹腔接種等量PBS作對照。

1.2.7 分離病原菌的藥物敏感性試驗(yàn)

按李軍等（2011）和秦若甫等（2011）方法進(jìn)行細(xì)菌的藥物敏感性測定[8,9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬山黑山羊主要疫病的病原檢測

通過對81個病例的病原檢測、分離和鑒定，確診細(xì)菌感染的病例59例，占全部病例的72.8%（59/81）；病毒感染的病例8例，占9%（8/81）；寄生蟲病12例，占14.8%（12/81）；中毒病2例，占2.5%（2/81）。檢測到的細(xì)菌性病原為綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、大腸桿菌、綠膿桿菌、奇異變形桿菌、偽結(jié)核棒狀桿菌和衣原體；病毒性病原為傳染性膿皰病毒；寄生蟲有擴(kuò)展莫尼次絳蟲、毛首線蟲等多種園線目線蟲、艾美耳球蟲和肝片吸蟲；中毒病為霉菌毒素中毒，見附表。

附表 馬山黑山羊病例和病原數(shù)

在81個病例中，有37個病例是支原體肺炎及其混合感染，占全部病例的45.7%（37/81），其中以綿羊肺炎支原體占多，達(dá)34例。對分離綿羊肺炎支原體的山羊致病性試驗(yàn)表明，攻毒后第2d，山羊出現(xiàn)體溫升高至39.8℃，并維持至高度后第17d；攻毒后第4d開始流鼻涕，第13d開始咳嗽，直至試驗(yàn)結(jié)束仍未康復(fù)；剖檢肺臟可見肺淤血，有不同程度出血性 “肝變”，甚至 “胰變”，這表明分離到的綿羊肺炎支原體具有一定的毒力，因此，綿羊肺炎支原體是馬山黑山羊的主要疫病病原。

分離到的大腸桿菌、綠膿桿菌、奇異變形桿菌、偽結(jié)核棒狀桿菌對小白鼠均具有致死性，表明這些細(xì)菌在感染過程中均有一定的毒力。利用凝集法對分離到的18株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清分型，鑒定出6個血清型，分別是O78（2株）、 O13（5株）、 O15（4 株）、 O20（3 株）、 O101（1 株）、O26（3株），O78能致羔羊和小白鼠發(fā)病死亡；O13、O15、O20、O101、O26能引起羔羊黃白痢。檢測到的衣原體病主要是引起流產(chǎn)和結(jié)膜炎。

2.2 馬山黑山羊病原菌的藥物敏感試驗(yàn)

分離到的細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)顯示，只有少數(shù)藥物，如環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星是敏感藥物，青霉素G、阿莫西林、林可霉素對細(xì)菌已經(jīng)無效。支原體藥物敏感試驗(yàn)顯示，壯觀霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考是高度敏感藥物。

3 討論

臨床病例診治分類調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果顯示，目前危害馬山黑山羊的主要疫病是細(xì)菌性傳染病占72.8%（59/81），病毒性疾病占9.9%（8/81）， 寄生蟲病占14.8%（12/81）， 霉菌中毒性疾病占2.5%（2/81）等。在細(xì)菌性傳染病中支原體肺炎占62.7%（37/59） （含和寄生蟲或其他細(xì)菌的混合感染）；大腸桿菌病占25.4%（15/59）； 衣原體病占6.8%（4/59）， 此外還有偽結(jié)核病、綠膿桿菌病和奇異變形桿菌病等。在病毒性疾病中以傳染性膿皰常見，寄生蟲病中以絳蟲和線蟲危害最大。這些疫病是當(dāng)前馬山黑山羊臨床上常發(fā)性疾病，其中支原體肺炎、傳染性膿皰、山羊痘、大腸桿菌病、絳蟲和線蟲病是防控重點(diǎn)。

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，目前馬山黑山羊的常見病原菌已經(jīng)對大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，因此，在今后治療時，不能盲目用藥，一定要做細(xì)菌的分離和藥物敏感性試驗(yàn)，選擇對細(xì)菌高度敏感藥物，按療程和使用劑量進(jìn)行治療。

從診治的病例來看，雖然未碰到鏈球菌病、梭菌性疾病、沙門氏菌病、布魯氏病等，但這些疾病在廣西其他地區(qū)的山羊中有發(fā)病或血清學(xué)檢測陽性的報道[10]，同樣要引起我們高度重視。隨著流通的增多、養(yǎng)殖規(guī)模的越來越大，導(dǎo)致場地和環(huán)境的污染必將會越來越嚴(yán)重，條件性致病菌的危害肯定會加大，混合性感染病例會增多，2014年小反芻獸疫在全國各地已經(jīng)發(fā)生，給山羊產(chǎn)業(yè)帶來更大的威脅。因此，在平時的養(yǎng)殖過程中，一定要強(qiáng)化飼養(yǎng)管理、增強(qiáng)防疫等綜合性防治措施，政府部門要加強(qiáng)防疫制度的建立，確保疫苗有效供給等，切實(shí)有效防止這些疾病的發(fā)生。

[1]閉炳芬,陶立,李軍,等.馬山黑山羊支原體肺炎病原的鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41（9）：249-253.

[2]陶立,藍(lán)顯利,閉炳芬,等.羔羊奇形變異桿菌與支原體混合感染的診斷[J].中國畜禽種業(yè),2014(12)：104-106.

[3]陶立,李軍,韋志鋒,等.廣西圈養(yǎng)山羊傳染性胸膜肺炎流行病學(xué)調(diào)查和綜合防治措施[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(1)：98-99.

[4]儲岳峰,高鵬程,趙萍,等.應(yīng)用雙重PCR方法檢測羊支原體肺炎病原[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41（12）：23-27.

[5]陳澤祥,禤雄標(biāo),許力干,等.鱉源格氏乳球菌的分離及鑒定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(10)：151-154.

[6]劉棋,黃夏,郭建剛,等.山羊痘病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006,28（5）：394-398.

[7]向智龍,程振濤,卓建華,等.羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38（7）：145-147.

[8]李軍,禤雄標(biāo),謝宇舟,等.廣西畜禽大腸桿菌O157：H7流行病學(xué)調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報,2011,27（12）：1151-1155.

[9]秦若甫,李智紅,韋志鋒,等.二株綿羊肺炎支原體藥物敏感性試驗(yàn)和臨床治療體會[J].廣西畜牧獸醫(yī),2011,27（3）：165-166.

[10]陶立,韋志鋒,蘭美益,等.廣西山羊主要疾病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37（2）：138-140.

廣西水產(chǎn)畜牧局科技項(xiàng)目（桂漁牧科072411，桂漁牧科08283-2）;南寧市科技攻關(guān)項(xiàng)目（20132312）。

藍(lán)金紅（1970-），女，廣西人，學(xué)士，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防治工作。

陶立（1964-），男，廣西人，學(xué)士，高級獸醫(yī)師，從事動物疫病的防治和研究。

楊威（1957-），男，廣西人，研究員，從事動物疫病的防治和研究。

黃明學(xué)（1964-），男，廣西人，畜牧獸醫(yī)師，從事動物疫病的防治和研究。