崔治龍 韋國渠 崔珍華 杜典策 冉隆淮

（1，貴州省沿河土家族自治縣草地中心 565300;2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025;3，貴州省三都縣周覃鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 558000）

貴州某豬場(chǎng)感染大腸桿菌的診治

崔治龍1韋國渠2,3*崔珍華1杜典策1冉隆淮1

（1，貴州省沿河土家族自治縣草地中心 565300;2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025;3，貴州省三都縣周覃鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 558000）

為查清某豬場(chǎng)發(fā)病斷奶仔豬死亡原因，采用流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理解剖診斷和生化鑒定等方法，對(duì)該豬場(chǎng)發(fā)病豬進(jìn)行診斷調(diào)查，確診為該豬場(chǎng)斷奶仔豬發(fā)病死亡的原因?yàn)樨i大腸桿菌感染所致。

豬場(chǎng);大腸桿菌;混合感染;診斷

大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）通常簡(jiǎn)稱為大腸桿菌，主要寄居于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，該菌在自然界分布廣泛，屬于條件致病菌[1]。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬急性傳染病，臨床上表現(xiàn)為腸炎、腸毒癥等多種癥狀。根據(jù)豬的生長(zhǎng)日齡與病原菌的血清型差異，該疾病可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病三種。這三種疾病造成新生仔豬大批死亡或生長(zhǎng)發(fā)育不良，成為嚴(yán)重影響規(guī)?；i廠發(fā)展的障礙之一[2]。

2015年3月，貴州某豬場(chǎng)送檢斷奶仔豬10頭，其中4頭死亡，6頭病危，一天后其余病危的6頭相繼死亡。為了解該豬場(chǎng)疫病的感染狀況，本試驗(yàn)對(duì)該豬場(chǎng)送檢的發(fā)病仔豬進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、解剖病理診斷和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，確診該病為豬大腸菌感染。

1 材料與方法

1.1 材料

病料：某規(guī)?；i場(chǎng)送檢的10頭發(fā)病斷奶仔豬。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20～40g小白鼠（購自貴陽醫(yī)學(xué)院）。

1.2 主要試劑

普通肉湯培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基（購自上海陽光生物技術(shù)有限公司）；MuellerHinton（M-H）瓊脂培養(yǎng)基（購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；革蘭氏染液（購自上?？婆d生物科技有限公司）；顯微鏡（購自日本OLYMPUS公司）；其他培養(yǎng)基、微量生化鑒定管和藥敏紙片（購自杭州微生物試劑有限公司）；瓊脂糖購自Biowest公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 流行病學(xué)調(diào)查

采用詢問送檢者與電話咨詢了解豬場(chǎng)發(fā)病狀況，并記錄結(jié)果。

1.3.2 臨床癥狀及剖檢病理變化

對(duì)該豬場(chǎng)送檢的10頭發(fā)病仔豬進(jìn)行臨床觀察及剖檢病理變化觀察，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。觀察10頭發(fā)病豬臨床癥狀，再全部解剖觀察病理變化，并比較其異同點(diǎn)，此時(shí)應(yīng)注意無菌操作。用灼燒過的手術(shù)刀（無菌操作）切開胸腹腔，首先吸取積液或以棉簽拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取內(nèi)臟器官，如淋巴結(jié)、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等。

1.3.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌條件下采集病變明顯的腎臟、肝臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織病料器官及心包、胸腔、關(guān)節(jié)積液直接接種普通瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱平板培養(yǎng)基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h后，觀察其不同培養(yǎng)基中被檢細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和菌落特征，然后挑取單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)。同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行涂片，革蘭氏染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4 生化特性鑒定

取分離菌株的純培養(yǎng)物分別接種于添加有0.07%NAD的微量生化鑒定管中，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

1.3.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法，即（K-B法）操作。用接種環(huán)挑取1～2環(huán)純培養(yǎng)的分離菌，接種于含5%脫纖綿羊血的M-H瓊脂培養(yǎng)基上，涂勻，選取12種常用藥敏紙片均勻地貼到培養(yǎng)基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.6 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)

取血液瓊脂平板上培養(yǎng)的24h菌落制成細(xì)菌懸液（CFU為5×108個(gè)∕ml），分別取0.5ml采取腹腔注射接種在生長(zhǎng)條件相同的10只小鼠，對(duì)照組10只注射等量生理鹽水。24h后觀察小白鼠發(fā)病及死亡情況，并剖檢小白鼠，無菌取其心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織作細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況

該豬場(chǎng)發(fā)病突然，精神沉郁，食欲不振，喘氣，被毛粗亂。發(fā)病后豬場(chǎng)曾使用青霉素、鏈霉素等抗生素進(jìn)行治療，病豬體溫有所降低，但發(fā)病后2～3d死亡。

2.2 臨床癥狀及剖檢病理變化檢測(cè)

2.2.1 臨床癥狀

病豬主要癥狀是脫水和下痢，黃痢仔豬排黃色稀便，內(nèi)含凝乳小塊。嚴(yán)重的精神沉郁，不吃奶，迅速脫水、昏迷而死亡。急性病例不見癥狀而昏迷死亡。白痢仔豬排出乳白色漿液狀、糊狀糞便。

2.2.2 剖檢病理變化

喉頭、扁桃體充血、皮下組織水腫；腸系膜淋巴結(jié)和下頜淋巴結(jié)充血、腫大，間有出血；小腸系膜發(fā)黃、有的腸套疊；腸粘膜充血、出血，腸壁變薄、松弛而失去彈性，腸絨毛上皮正?；蛭s、伴有炎癥；肝臟邊緣呈紫黑色、表面有許多散在顆粒狀大小的白色壞死斑點(diǎn)；腎臟表面有針尖大小出血點(diǎn)，腎上腺切面散在壞死點(diǎn)。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

無菌采集取病死豬的引肝、肺、腎、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)病料接種在普通瓊脂平板、血液瓊脂平板麥康凱，SS瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h后。淋巴結(jié)接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成直徑約2mm的圓形、光滑、隆起、濕潤(rùn)、半透明淡灰色的菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成較大的呈光滑、濕潤(rùn)、圓形、表而隆起的粉紅色菌落，部分致病性菌株在血液瓊脂平板上呈β溶血環(huán)。用接種棒挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色制成涂片，通過涂片鏡檢為革蘭氏陰性菌，兩極濃染，兩端鈍圓的短小桿菌，偶有2～3個(gè)菌體相連，無芽孢（附圖），符合大腸桿菌形態(tài)特性。

附圖 豬大腸桿菌染色后觀察結(jié)果（10×100）

2.4 生化特性鑒定

將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管中，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h后，結(jié)果（見表1）。經(jīng)生化實(shí)驗(yàn)鑒定分析該分離株對(duì)硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對(duì)照、棉子糖、測(cè)金盞花醇、木膠糖12種發(fā)酵管反應(yīng)呈陽性，對(duì)葡磷胨水、山梨醇2種發(fā)酵管反應(yīng)呈陰性。其他生化實(shí)驗(yàn)中，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性，VP實(shí)驗(yàn)陰性，枸櫞酸酸鹽利用實(shí)驗(yàn)呈陰性，七葉苷水解實(shí)驗(yàn)呈陽性，均符合大腸桿菌生化特性。

表1 大腸桿菌生化特性鑒定結(jié)果

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表2）。根據(jù)NCCLS[3]的標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性，結(jié)果表明，從該豬場(chǎng)分離的病原菌對(duì)頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平高敏，對(duì)鏈霉素和妥布霉素中敏，而對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星和四環(huán)素已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。

表2 大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

接種了分離菌的小白鼠均在24～48h內(nèi)死亡，對(duì)照組沒有死亡。無菌取死亡小白鼠的心臟、肝臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，結(jié)果經(jīng)分離提純后鑒定，與以上特性相一致，確診為有大腸桿菌的感染。

3 討論與分析

通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、剖檢病理診斷，初步診斷該豬場(chǎng)斷奶仔豬存在細(xì)菌感染。取發(fā)病豬的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等組織，通過進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化特性、培養(yǎng)特性及動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定確診該細(xì)菌為大腸桿菌。藥敏實(shí)驗(yàn)表明，該規(guī)?；i場(chǎng)感染的大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星和四環(huán)素已經(jīng)產(chǎn)生了較高的耐藥性，這可能是由于該豬場(chǎng)管理欠缺，用藥不規(guī)范，療程不當(dāng)，長(zhǎng)期使用同一類藥物或長(zhǎng)期在飼料、飲水中加入預(yù)防性用藥導(dǎo)致，這應(yīng)引起高度重視；對(duì)鏈霉素和妥布霉素中敏；而對(duì)頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平高敏，這可能是因?yàn)轭^孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平在該豬場(chǎng)并未廣泛使用，因此該豬場(chǎng)在治療時(shí)可先把頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。對(duì)于混合或多重繼發(fā)感染的情況，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)癥下藥，避免亂用藥而造成的仔豬的死亡。

綜合分析以上結(jié)果，建議該豬場(chǎng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并合理投喂抗生素避免繼發(fā)感染，同時(shí)將可疑豬和病豬全部隔離飼養(yǎng)，病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋，對(duì)污染的圈舍和四周環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，患病豬群則隔離治療并帶豬消毒，對(duì)新購進(jìn)豬要進(jìn)行嚴(yán)格的隔離、檢疫。目前很多規(guī)模化豬場(chǎng)都存在綜合防治措施不完善，飼養(yǎng)管理水平有限，預(yù)防意識(shí)淡薄等為疾病的發(fā)生和傳播提供了條件，通過改善動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，增加機(jī)體免疫力，是防治大腸桿菌病的基礎(chǔ)[3]。因此，豬場(chǎng)只有建立健全獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度，搞好日常衛(wèi)生管理工作，嚴(yán)格引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出，合理使用預(yù)防藥物等綜合防治措施，才能最大限度的減少疫病的發(fā)生。

[1]李振貴.豬偽狂犬病的防控建議[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013(12):97-98.

[2]楊鮮銀.豬大腸桿菌病的診斷[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013(7):134.

[3]NCCL S.Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:Twentieth informational Supplement[J].NCCL S,Wayne,Pennsylvania,2010,30(1)：86-88.

崔治龍（1969-），男，獸醫(yī)師，主要從事基層動(dòng)物疫病防控工作。

?通訊作者：韋國渠（1986-），男，在職碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病防控及農(nóng)業(yè)科技推廣。