于延輝魯衍強李 瑛，＊湯 萍宋錦霞馮鐵利楊 琦

1.吉林省延邊婦幼保健院（延吉，133001）；2.上海靶向分子醫(yī)學研究所；3.吉林省延邊州衛(wèi)生局；4中國疾病預防控制中心婦幼保健中心

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）是參與體內葉酸代謝的關鍵酶，MTHFR和MTRR具有多種基因多態(tài)性，目前國內外研究最多的是 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G。已有研究表明這些基因多態(tài)性影響著其編碼酶的活性、體內葉酸以及同型半胱氨酸水平［1-2］。此外，國內外研究結果顯示，MTHFR的多態(tài)性位點C677T和A1298C以及MTRR的多態(tài)性位點A66G在不同國家、同一國家不同地區(qū)以及不同民族間的分布情況存在差異［3-5］。我國是人口大國，也是出生缺陷高發(fā)國家。出生缺陷的發(fā)生與母體內同型半胱氨酸水平的升高密切相關，是神經(jīng)管畸形［6］、復發(fā)性流產(chǎn)［7］、妊娠期高血壓［8］等疾病的危險因素，嚴重影響母嬰健康。漢族人群是我國的主要人群，本研究針對延邊州漢族女性開展分子流行病學調查，旨在闡明本地區(qū)漢族人群的遺傳特征，為個體化的孕期保健提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2014年12月到延邊婦幼保健院進行孕前與孕期檢查的漢族女性，排除籍貫非本州者，入組對象共2620例，年齡（28.50±4.25）歲。簽署知情同意書后采集口腔黏膜細胞，利用硅膠吸附方法提取樣本的基因組DNA。

1.2 基因分型

采用熒光定量PCR技術，檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多態(tài)性。相關儀器、試劑均購自美國ABI公司。每個反應體系10μl：1μl DNA模板（20ng／μl），5μlTaqman Universal Master Mix，0.5μlTaqman-MGB探針，3.5μl去離子水。反應條件：95℃預變性10min，92℃變性15s，60℃延伸1min，20個循環(huán)；89℃變性15s，60℃延伸90s，30個循環(huán)。反應完成后，在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，應用HaploView4.2軟件進行單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的Hardy-Weinberg平衡、LD水平和單倍型結構分析。計數(shù)資料采用率表示，對基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G 基因多態(tài)性，對3個位點進行H-W平衡檢驗，檢驗結果分別為P＝0.09（C677T）、P＝0.08（A1298C）、P＝0.88（A66G），符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明樣本具有本區(qū)域群體代表性。

2.2 MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率在不同地區(qū)漢族女性中的比較

延邊州漢族女性的 MTHFR C677T和A1287C，MTRR A66G位點的基因型和等位基因頻率分布具有地域性特點，詳見表1、表2。

2.3 MTHFR C6.7 T和A12.8 C兩位點連鎖情況及單倍型分析

MTHFR C677T和A1298C兩位點組合情況見表3。單倍型分析表明，4種組合頻率分別為677T-1298A（55.0%）、677C-1298A（30.2%）、677C-1298C（14.7%）、677T-1298C（0.1%），兩位點存在高度連鎖不平衡現(xiàn)象（D’＝0.99）。

表1 本研究與不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)和頻率比較［n（%）］

表2 本研究與不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)和頻率分布比較［n（%）］

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布［n（%）］

3 討論

MTHFR及MTRR在同型半胱氨酸向蛋氨酸的轉化及DNA的合成過程中發(fā)揮重要作用。MTHFR基因定位于1p36.3，迄今為止已發(fā)現(xiàn)近20種SNPs。其中最常見的是MTHFR 677位點C→T的點突變。而MTRR基因定位于5p15.2～15.3，MTRR是蛋氨酸合成酶的輔助因子，催化甲基鈷胺再生［20］，MTRR最常見的SNP為66A→G，其突變結果是異亮氨酸取代蛋氨酸。

據(jù)報道，在葉酸攝入量無顯著性差異的情況下，攜帶677TT基因型的個體與TC或CC型個體相比，血清葉酸水平低20% 左右［21］。隨著人們生活水平的提高，環(huán)境和營養(yǎng)因素都得到重視，如何從遺傳角度篩查出疾病易感人群，并在生活行為、飲食營養(yǎng)等方面加以強化，從而達到降低出生缺陷及孕產(chǎn)婦疾病的目的就顯得尤為重要。

2007年延邊州出生缺陷監(jiān)測結果顯示，位居前5位分別是先心病、總唇裂、多指趾、腦積水和小耳［22］。本研究通過與其他地區(qū)大樣本數(shù)據(jù)進行對比分析，發(fā)現(xiàn)延邊州漢族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點多態(tài)性與其他地區(qū)漢族女性的頻率存在差異。延邊州漢族女性MTHFR C677T位點的基因型和等位基因頻率與烏魯木齊、廊坊、銀川、濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、德陽、惠州、南寧、瓊海等地差異有統(tǒng)計學意義。T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢。延邊州漢族女性MTHFR A1298C位點的基因型和等位基因頻率與濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、德陽、惠州、南寧、瓊海等地差異有統(tǒng)計學意義。C等位基因頻率呈現(xiàn)北方低南方高的趨勢。延邊州漢族女性MTRR A66G位點的基因型和等位基因頻率與德陽、瓊海等地差異有統(tǒng)計學意義，與烏魯木齊、廊坊、銀川、濟源、淄博、鎮(zhèn)江、湘潭、惠州、南寧等地差異沒有統(tǒng)計學意義。G等位基因頻率在各地區(qū)的分布暫無明顯規(guī)律。而有研究表明，延邊州朝鮮族女性MTHFR 677CC、CT、TT的分布比例分別為31.0%、50.2%、18.8%，其中TT型的比例與當?shù)貪h族女性分布差異有統(tǒng)計學意義［23］。

分析這種差異可能與人群對多種疾病的群體易感性有關。MTHFR 677T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢，與我國出生缺陷發(fā)病率北方高南方低的趨勢一致。C677T和A1298C存在協(xié)同作用，雙雜合子個體與僅含C677T突變的個體相比，同型半胱氨酸濃度顯著升高。本文研究顯示雙雜合子占15.4%，與Benrahma等［24］報道的結果一致。此外，單倍型分析的結果顯示，延邊州漢族女性MTHFR C677T和A1298C兩位點組合單倍型以677T-1298A居多，張婷等［25］報道的貴州布依族、侗族和苗族的單倍型分析結果顯示均以677C-1298A類型居多。該差異或可體現(xiàn)不同民族間的遺傳情況存在差異。

分子生物學與遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，個體疾病的易感性不僅與環(huán)境因素相關，更與不同等位基因導致的表達差異相關。MTHFR及MTRR的基因多態(tài)性存在地區(qū)和民族的差異［17，19］，因此對孕婦實施個體化補充葉酸顯得尤為重要。而現(xiàn)行的公共衛(wèi)生政策并未實現(xiàn)因地區(qū)而異、因民族而異，本研究給個體化醫(yī)療提供了理論基礎。對本地人群的MTHFR和MTRR相關位點的多態(tài)性調查有助于進一步了解當?shù)貪h族人群的遺傳特征，為基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的相關性提供理論依據(jù)，同時也為改善公共衛(wèi)生政策提供依據(jù)。

［1］賀憲民，張群，楊琦，等.亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究［J］.中國計劃生育學雜志，2010，18（1）：13-17.

［2］陳惠麗，唐落韻，陳春寶.不明原因復發(fā)性流產(chǎn)與亞甲基四氫葉酸還原酶及甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21（6）：29-36.

［3］Cooper DS，Doherty GM，Haugen BR，et al.Management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer［J］.Thyroid，2006，16（2）：109-142.

［4］Yeung MJ，Serpell JW.Management of the solitary thyroid nodule［J］.Oncologist，2008，13（2）：105-112.

［5］Kim MJ，Kim EK，Kwak JY，et al.Differentiation of thyroid nodules with macrocalcifications：role of suspicious sonographicfindings［J］.Ultrasound Med，2008，27（8）：1179-1184.

［6］保睿，吳建新.人類神經(jīng)管缺陷分子遺傳學研究進展［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17（5）：1-4.

［7］尹璐，呂永剛.亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)的相關性分析［J］.吉林醫(yī)學，2012，33（21）：4520-4521.

［8］左金玲，易建平，陳寶麗.妊娠高血壓綜合征基因遺傳學研究進展［J］.中國婦幼保健，2011，26（24）：3822-3824.

［9］郝友瑛，趙紅，魯衍強，等.新疆維吾爾族和漢族女性 MTHFR和MTRR基因單核苷酸多態(tài)性比較.［J］.中國婦幼保健，2014，29（21）：3495-3497.

［10］李俊華，魯衍強，馬少杰，等.廊坊市漢族女性 MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分析［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2014，34（11）：1564-1565.

［11］劉曉玲，魯衍強，李瑛，等，銀川市漢族女性 MTHFR與MTRR基因多態(tài)性研究［J］.寧夏醫(yī)科大學學報，2014，36（11）：1216-1219.

［12］陳小利，魯衍強，馬少杰，等.濟源市漢族女性 MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布研究［J］.中國婦幼衛(wèi)生雜志，2014，5（4）：17-20.

［13］從玉英，魯衍強，芮欣憶，等.淄博市漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性分布研究［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2012，21（10）：779-781.

［14］楊彥，魯衍強，芮欣憶，等.鎮(zhèn)江市漢族女性 MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布研究［J］.南京醫(yī)科大學學報：自然科學版，2012，32（9）：1250-1253.

［15］王淑媛，魯衍強，馬少杰，等.湘潭市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布及其與血漿Hcy水平的關系［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（12）：1205-1208.

［16］張勇，朱正英，王瑋，等.四川德陽地區(qū)漢族女性人群MTHFR和MTRR基因多態(tài)性研究［J］.中國循證醫(yī)學雜志，2012，12（6）：631-634.

［17］高利潔，魯衍強，芮欣憶，等.惠州市漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成還原酶基因多態(tài)性分布研究［J］.中山大學學報（醫(yī)學科學版），2013，34（1）：140-143.

［18］蔣武，魯衍強，李瑛，等.南寧市壯族和漢族女性 MTHFR和 MTRR基因單核苷酸多態(tài)性比較［J］.廣西醫(yī)學，2014，36（11）：1517-1519.

［19］顏珠苗，魯衍強，李瑛，等.瓊海市漢族女性 MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布研究［J］.海南醫(yī)學院學報，2013，19（1）：18-20.

［20］張艷麗，李華鋒，伏廣照，等.孕期個體化補充葉酸預防胎兒神經(jīng)管缺陷效果觀察［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（30）：72-73.

［21］Nishio K，Goto Y，Kando T，et al.Serum folate and methyleuetetrahydrofolatereductase （MTHFR）C677Tpolymorphisnl adjusted for folate intake［J］.J Epidemio1，2008，18（3）：125-131.

［22］樸今蘭，宋錦霞，金英華，等.2007年延邊州出生缺陷監(jiān)測結果分析［J］.中國婦幼保健，2009，24（6）：824-825.

［23］于延輝，魯衍強，李瑛，等.延邊朝鮮族自治州漢族女性和朝鮮族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布研究［J］.實用醫(yī)學雜志，2014，30（5月增刊）：7-9.

［24］Benrahma H，Abidi O，Melouk L，et al.Association of the C677TPolymorphism in the Human Methylenetetrahydrofolate Reductase（MTHFR）Gene with the Genetic Predisposition for Type 2Diabetes Mellitus in a Moroccan Population［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2012，16（5）：383-387.

［25］張婷，謝淵，李毅，等.貴州3個民族亞甲基四氫葉酸還原酶基因的遺傳多態(tài)性［J］.重慶醫(yī)學，2013，42（28）：341-343.