梁 健, 雷雅雲(yún), 李永仁, 郭永軍, 邢克智

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院, 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300384)

青蛤(Cyclina sinensis)屬簾蛤目、簾蛤科、環(huán)文蛤?qū)?。主要分布于朝鮮半島、中國大陸、臺(tái)灣海區(qū), 常棲息在近高潮區(qū)和中潮區(qū)的泥沙灘中[1-2]。青蛤生長速度快, 適應(yīng)能力強(qiáng), 分布廣泛, 種群密度大, 是重要的經(jīng)濟(jì)貝類。另外, 由于青蛤成體移動(dòng)性差, 活動(dòng)范圍較小, 且為濾食性, 易蓄積環(huán)境中的重金屬離子, 造成自身損害[2]。近年隨沿海經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,工業(yè)和生活污水的排放量增大, 近岸海域重金屬污染日趨嚴(yán)重。有關(guān)重金屬對灘涂貝類的毒性、免疫指標(biāo)的報(bào)道很多, 如 Cd2+[3]、Pb2+[4]、Hg2+[5]、Zn2+[6]、Cu2+[7]等。但對于銅離子在青蛤體內(nèi)不同組織的蓄積及對免疫機(jī)能的影響尚未見報(bào)道。銅作為一種生物體必須元素, 在自然界中少量的存在不會(huì)直接威脅到生物體的生存, 但會(huì)通過食物鏈的蓄積作用間接威脅到末端生物的健康。本研究在測定 Cu2+對青蛤的半致死濃度和安全濃度基礎(chǔ)上, 觀察在不同濃度Cu2+的脅迫下青蛤各組織中蓄積情況及血淋巴液中免疫指標(biāo)的變化趨勢, 探索青蛤的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制,以期為青蛤健康養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤取自天津獨(dú)流減河河口, 個(gè)體健康、大小相似, 平均殼長35.32 mm±0.89 mm。在室內(nèi)暫養(yǎng)5 d,養(yǎng)殖用水為砂濾海水, 鹽度25, 溫度25～28℃, 暫養(yǎng)期間連續(xù)充氧, 每天全量換水1次, 投喂小球藻。暫養(yǎng)后選擇閉殼能力強(qiáng)、反應(yīng)迅速的個(gè)體作為試驗(yàn)用貝。

1.2 Cu2+對青蛤的急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 參照周永欣等[8]的等對數(shù)間距法設(shè)置Cu2+離子6個(gè)濃度, 分別為0.03、0.06、0.13、0.25、0.50和1.00 mg/L, 及空白對照, 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。每組飼養(yǎng)青蛤10枚, 實(shí)驗(yàn)期間不投餌、不充氣,每天半量換水1次, 及時(shí)挑出死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)開始后24、48、72、96 h統(tǒng)計(jì)各組青蛤死亡數(shù)。貝殼張開, 外套膜收縮, 用玻璃棒輕輕觸碰長時(shí)間未反應(yīng)的個(gè)體視為死亡。

1.3 青蛤?qū)u2+的蓄積實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將健康青蛤暴露在 Cu2+的半致死濃度和安全濃度兩種濃度(由前面實(shí)驗(yàn)所得出)的養(yǎng)殖環(huán)境中, 設(shè) 3個(gè)平行, 每組150個(gè)個(gè)體。實(shí)驗(yàn)期間不投餌、不充氣,每天半量換水1次, 及時(shí)挑出死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)開始后6、12、36、72、96、120和168 h, 各實(shí)驗(yàn)組解剖青蛤5個(gè), 分離鰓和內(nèi)臟團(tuán)并稱重記錄。

1.3.2 Cu2+含量測定

消化試管加入樣品和消化液(硝酸和高氯酸 4∶1), 加熱消化至液體澄清, 用 1%的硝酸定容。利用天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心提供的原子吸收分光光度計(jì)測定Cu2+濃度。

1.4 免疫指標(biāo)測定

在蓄積實(shí)驗(yàn)中, 分別在 6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h時(shí)間點(diǎn)取樣, 并設(shè)自然海水為對照。每組隨機(jī)選取5枚青蛤, 從圍心腔抽取血淋巴液并混合。在6 000 r/min、4℃下離心10 min, 取上清液, 使用南京建成生物工程公司提供的試劑盒測定超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活性及總蛋白的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算半致死濃度、95%置信區(qū)間和相關(guān)系數(shù)R。并用T-test對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

安全濃度的計(jì)算參照公式[9]:

安全濃度(SC)=96h LC50×AF

其中: AF為應(yīng)用系數(shù), 設(shè)為0.01。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+對青蛤的急性毒性

通過線性回歸統(tǒng)計(jì)分析, 得到死亡率概率單位與Cu2+濃度對數(shù)的相關(guān)方程為y=0.146+1.568x, 相關(guān)系數(shù)R2=0.897。半致死濃度LC50=0.807 mg/L, 95%置信區(qū)間為0.548～1.533 mg/L, 安全濃度為0.008 07 mg/L。

2.2 青蛤?qū)u2+的蓄積

半致死濃度脅迫下, 青蛤外殼緊閉, 活動(dòng)逐漸減少。由表2可知, Cu2+在青蛤鰓和內(nèi)臟團(tuán)的含量隨時(shí)間延長而升高, 在鰓中 72～120 h增長迅速, 隨后變得平穩(wěn), 在 168 h達(dá) 8.95μg/g, 平均蓄積速度0.053μg/(g·h)。Cu2+在內(nèi)臟團(tuán)中蓄積緩慢, 168 h 達(dá)到6.28μg/g, 平均蓄積速度為 0.037μg/(g·h)。整個(gè)過程中, 鰓中的Cu2+含量始終高于內(nèi)臟團(tuán)。

表1 不同濃度Cu2+對青蛤的急性毒性Tab.1 Mortality of C. sinensis exposed to different concentrations of Cu2+

表2 半致死濃度(0.807 mg/L)脅迫下青蛤各組織內(nèi)Cu2+含量Tab. 2 Cu2+ contents in different tissues of C. sinensis at LC50 (0.807 mg/L)

由表3可知, 安全濃度下, 6 h時(shí)鰓和內(nèi)臟團(tuán)Cu2+的含量分別為3.8μg/g和2.01μg/g, 且在12 h內(nèi)增加明顯, 隨后隨處理時(shí)間延長緩慢升高。在鰓中的平均蓄積速度為0.033μg/(g·h), 內(nèi)臟團(tuán)中平均蓄積速度為0.014μg/(g·h), 鰓組織中Cu2+的含量始終高于內(nèi)臟團(tuán)。

表3 安全濃度脅迫(0.008 07 mg/L)下青蛤各組織內(nèi)Cu2+含量Tab. 3 Cu2+ contents in different tissues of C. sinensis at the safe concentration (0.00 807 mg/L)

2.3 Cu2+對青蛤生化指標(biāo)的影響

由圖1可知, 兩實(shí)驗(yàn)組SOD活性均高于對照組,半致死濃度處理組從6 h起SOD活性與對照組差異顯著(P<0.05), 且逐漸增加, 并于 24 h時(shí)達(dá)峰值81.55 U/mg; 隨后SOD活性下降, 在144 h時(shí)與對照組差異不顯著(P>0.05); 該處理組全程 SOD活性變化呈“誘導(dǎo)-抑制”趨勢。安全濃度處理組SOD活性穩(wěn)定, 且顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴SOD活性比較Fig.1 Comparison of the SOD activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

圖2可知, 在36～72 h, 處理組CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)。半致死濃度處理組在12～48 h內(nèi)CAT活性增長緩慢, 在72 h達(dá)峰值12.35 U/mg, 在96～168 h階段, 與對照組差異不顯著。安全濃度處理組在6～48 h內(nèi)變化不大, 在72 h達(dá)峰值12.26 U/mg。表現(xiàn)出“誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)”趨勢。

圖2 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴CAT活性比較Fig.2 Comparison of the CAT activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

圖3可知, 6～72 h階段, 處理組ACP活性與對照組差異顯著(P<0.05), 且半致死濃度處理組誘導(dǎo)效應(yīng)更為明顯, 在24 h時(shí)出現(xiàn)峰值3.25 U/mg; 安全濃度處理組ACP活性保持穩(wěn)定, 且高于對照組。

圖3 不同濃度下Cu2+的青蛤血淋巴ACP活性比較Fig.3 Comparison of the ACP activity of haemolymph in C.sinensis with different concentrations of Cu2+

3 討論

3.1 Cu2+在青蛤體內(nèi)的蓄積

本研究中得到的Cu2+對青蛤的96 h半致死濃度LC50=0.807 mg/L, 安全濃度為0.008 07 mg/L, 張麗巖等[3]研究中指出 Cd2+對青蛤的半致死濃度為LC50=20.09 mg/L, 安全濃度為 0.201 mg/L, 這個(gè)數(shù)值是Cu2+的近24倍, 說明青蛤?qū)τ贑u2+的耐受性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Cd2+。

在半致死濃度和安全濃度脅迫下, 青蛤?qū)?Cu2+的蓄積能力順序?yàn)轹w>內(nèi)臟團(tuán), 這可能與貝類自身生理特性有關(guān)。重金屬在貝類組織內(nèi)的蓄積通常有以下幾種方式: 一是在呼吸過程中由表皮滲透入鰓組織中, 通過血液循環(huán)被輸送到其他組織器官; 二是在攝食消化過程中間接地被貝類所攝入。鰓作為呼吸器官直接接觸到環(huán)境中的 Cu2+, 而在試驗(yàn)過程中不投喂餌料, 降低內(nèi)臟團(tuán)通過食物對 Cu2+的蓄積量,導(dǎo)致鰓對 Cu2+的蓄積能力大于內(nèi)臟團(tuán)。體表與水體的滲透交換作用是重金屬進(jìn)入貝類體內(nèi)的一個(gè)重要途徑[10], 主要有以下的兩種模型: 高親和力的重金屬和蛋白結(jié)合后被水生生物攝入體內(nèi); 重金屬離子通過活性泵作用運(yùn)輸?shù)剿矬w內(nèi)。這導(dǎo)致試驗(yàn)期間未投喂餌料而內(nèi)臟團(tuán)具有對Cu2+的蓄積作用。

本試驗(yàn)中所得出的 Cu2+安全濃度(0.008 07 mg/L),未超出國家農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《無公害食品標(biāo)準(zhǔn)——淡水海水養(yǎng)殖水質(zhì)》中所要求的0.01 mg/L[11], 而張麗巖等[13]研究 Cd2+對青蛤的安全濃度為 0.201 mg/L, 高于國家標(biāo)準(zhǔn)(0.005 mg/L)40倍。

3.2 Cu2+對青蛤抗氧化酶活性的影響

貝類的免疫主要是其血淋巴液中的細(xì)胞免疫和體液免疫, 其中, 血細(xì)胞是貝類執(zhí)行細(xì)胞免疫的主要功能因子, 是無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的首道防線,外界環(huán)境的變化會(huì)對血細(xì)胞的免疫能力產(chǎn)生巨大影響[12]。

一些研究表明, 當(dāng)貝類受到污染脅迫時(shí), 能夠通過呼吸爆發(fā)作用產(chǎn)生大量活性氧, 用以幫助機(jī)體清除進(jìn)入體內(nèi)的病原, 但過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致生物體體內(nèi)細(xì)胞膜的脂質(zhì)化程度加快, 造成損傷, 此時(shí),生物體會(huì)自動(dòng)激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng), 以避免活性氧對自身細(xì)胞的傷害[13-14]。丁鑒峰等[15]發(fā)現(xiàn), 隨著不同地區(qū)的污染程度加重SOD活性逐漸升高, 但當(dāng)污染程度達(dá)到一定時(shí), SOD活性會(huì)急劇下降, 生物體內(nèi)出現(xiàn)大量氧自由基, 損傷機(jī)體。陳林林等[5]的研究結(jié)果表明, 重金屬能夠在短期內(nèi)增加紫貽貝抗氧化酶的活性, 但隨著脅迫時(shí)間的延長, 便會(huì)抑制相關(guān)抗氧化酶的活性。在本研究中, 半致死濃度(0.807 mg/L)脅迫下青蛤血淋巴液中SOD和CAT的活性均出現(xiàn)了先誘導(dǎo)再抑制的趨勢, 這一現(xiàn)象與上述的研究結(jié)論相一致。在脅迫初期, 體內(nèi)迅速產(chǎn)生活性氧, 激活其抗氧化能力, 體內(nèi)SOD和CAT活性上升, 以保證其細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化程度最低。隨著時(shí)間的延長, 過多的活性氧便會(huì)抑制SOD和 CAT的產(chǎn)生和活性, 便會(huì)出現(xiàn)試驗(yàn)后期SOD活性降低的趨勢。貝類在長時(shí)間重金屬脅迫下, SOD、CAT活性則在一段時(shí)間后出現(xiàn)大幅度的降低, 表明高濃度金屬離子脅迫下抗氧化酶的活性抑制。

而在安全濃度(0.008 07 mg/L)下, 處理組表現(xiàn)出SOD、CAT活性水平高于對照組, 但誘導(dǎo)趨勢不及半致死濃度處理組顯著。說明 Cu2+脅迫對 SOD、CAT活性的誘導(dǎo)與濃度相關(guān), 在較低濃度時(shí), 誘導(dǎo)效應(yīng)和抑制效應(yīng)較弱, 隨濃度增加, 誘導(dǎo)效應(yīng)加強(qiáng), 達(dá)峰值后, 抑制效應(yīng)也表現(xiàn)顯著。

3.3 Cu2+對青蛤水解酶活性的影響

磷酸水解酶(ACP), 簡稱磷酸酶, 是一類酸性水解酶, 存在于貝類血細(xì)胞溶酶體中, 當(dāng)外來異物進(jìn)入體內(nèi)或環(huán)境發(fā)生變化時(shí), 變可以通過胞內(nèi)和胞外途徑, 催化有機(jī)磷酸水解, 釋放磷酸根離子, 參與對異物以及病原的殺傷和清除[15]。本研究中, 半致死濃度脅迫下青蛤血淋巴液中ACP活性呈現(xiàn)出先升高后抑制的趨勢, 脅迫初期產(chǎn)生誘導(dǎo)現(xiàn)象的原因可能與抗氧化酶機(jī)制一致; 脅迫后期ACP活性的降低可能通過以下兩條途徑所導(dǎo)致: 一是由于污染物造成的貝類血細(xì)胞溶解, 導(dǎo)致含有 ACP的溶酶體失活; 二是污染物可能改變血細(xì)胞內(nèi)溶酶體的膜通透性, 導(dǎo)致ACP滲漏[16]。

綜上所述, 青蛤養(yǎng)殖環(huán)境中的重金屬 Cu2+能夠產(chǎn)生蓄積作用, 且鰓的蓄積能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于內(nèi)臟團(tuán);Cu2+對青蛤的安全濃度并未超過國標(biāo)中海水淡水養(yǎng)殖水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定; 高濃度 Cu2+能夠誘導(dǎo)青蛤產(chǎn)生免疫抑制并導(dǎo)致其抗病能力下降, 加之其他污染物的影響可能是導(dǎo)致夏季青蛤大規(guī)模死亡的重要誘因。因此維護(hù)養(yǎng)殖環(huán)境, 減少重金屬的排放, 是防止青蛤爆發(fā)性死亡的有效途徑。

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