程雪艷, 滕爽爽 , 肖國強(qiáng) , 邵艷卿 , 張炯明 , 方 軍 , 柴雪良

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005; 3. 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)和保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 溫州 325001)

泥蚶(Tegillarca granosa)屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae), 是一種棲息于沿海灘涂的廣溫廣鹽性雙殼貝類, 在我國主要分布于山東以南沿海[1], 是我國主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一, 具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。但近年來, 過度釆捕和生態(tài)環(huán)境的改變對泥蚶的自然資源造成嚴(yán)重的破壞。人工養(yǎng)殖的泥蚶種質(zhì)大多是未經(jīng)遺傳改良的野生型, 在經(jīng)過多年累代養(yǎng)殖后,已出現(xiàn)種質(zhì)退化等制約泥蚶養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的現(xiàn)象[2]。因此, 有必要對泥蚶遺傳背景進(jìn)行深入調(diào)查研究, 為泥蚶自然資源的恢復(fù)和遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

目前, 對于泥蚶群體的遺傳多樣性的研究涉及形態(tài)學(xué)水平[1,3]、同工酶水平[4-5], DNA分子水平[3,6-8]等方面。微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)廣泛分布于真核生物基因組中, 由 2～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成。又稱為簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats)或短串聯(lián)重復(fù)序列(simple tandem repeats, STRs)[9]。由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性豐富、共顯性標(biāo)記、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好以及結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[10], 被廣泛應(yīng)用于物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析。在水產(chǎn)動物種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析中已被廣泛使用, 如海灣扇貝(Argopecten irradias)[11]、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[12]、文蛤(Meretrix meretrix)[13]、長牡蠣(Crassostrea gigas)[14]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[15-16]、馬氏珠母貝(Pinctada fucata)[17]、斧文蛤(Meretrix lamarckii)[18]等。

本研究采集了韓國以及我國沿海地區(qū) 5個地理群體泥蚶, 利用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的泥蚶 SSR引物對 5個群體進(jìn)行比較分析, 對泥蚶的遺傳多樣性水平進(jìn)行評估, 為更好地開發(fā)利用該物種生物資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

泥蚶(T. granosa)的 5個地理群體分別取自浙江樂清(ZJ), 廣西企沙(GX), 海南海口(HN), 山東日照(SD),韓國釜山(KR)等地海域, 5個地理群體均為自然群體,數(shù)量分別為 24、23、23、26、24個。樣品采集后活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室, –70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

將所采集樣品分別解剖, 取閉殼肌組織?；蚪MDNA提取采用酚-氯仿法抽提[19], 對所提取DNA進(jìn)行純度、濃度以及完整性檢測后, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測

本研究所用引物由本課題組開發(fā)設(shè)計(jì)而成[20],引物序列及退火溫度見表1, 引物由上海生工生物工程有限公司合成。在Eppendorf擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系: 10×PCR buffer(Mg2+plus)1.5 μl,2.5 mmol/L dNTP 1.2 μl, 10 μmol/L 上下游引物各 1.5 μl,Taq 酶(5 U/μl)0.075 μl, DNA 模板 100 ng, 滅菌水補(bǔ)足至15 μl。PCR反應(yīng)條件設(shè)置: 94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30個循環(huán); 最后72℃延伸7 min。PCR結(jié)束后取4 μl擴(kuò)于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(1×TBE, 5 V/cm 恒壓),DuGreen染色, 凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后將產(chǎn)物于 4℃保存, 擴(kuò)增產(chǎn)物用 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

表1 泥蚶17個微衛(wèi)星位點(diǎn)的特性Tab.1 Characteristics of 17 microsatellites for T. granosa

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 泥蚶5個地理群體遺傳參數(shù)分析

使用17對微衛(wèi)星引物對泥蚶5個不同地理群體共120個樣品進(jìn)行了DNA檢測, 17對引物在5個泥蚶群體中分別檢測到 102(山東)、99(廣西)、91(海南)、86(韓國)、99個(浙江)等位基因, 由于不同群體檢出的等位基因不一致, 共獲得115個不同等位基因。不同位點(diǎn)檢測的等位基因數(shù)為2～12個不等, 其中位點(diǎn)Teg39等位基因數(shù)最多, 為12個等位基因; Teg12次之, 為11個等位基因; Teg18最少, 為2個等位基因。其中Teg28在其他群體中為2～3個等位基因, 在韓國群體中為1個等位基因。

通過基因產(chǎn)生的頻率計(jì)算17個位點(diǎn)的PIC(表2),17個位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息含量為0.142～0.857。其中Teg18最低, 為0.142; Teg28、Teg24、Teg8的多態(tài)性信息含量為0.176、0.273、0.377, 10個位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量在0.5以上, 表現(xiàn)出高度多態(tài)性。5個群體的PIC為0.525～0.608, 說明泥蚶5個群體的遺傳多樣性處于中等偏上水平。

5個地理群體的平均觀測雜合度 Ho為 0.430～0.516, 平均期望雜合度He為0.573～0.656, 其中山東群體的Ho和He均為最高。

在85個群體位點(diǎn)中, Teg28在韓國群體中的位點(diǎn)為單態(tài)的, 對84個多態(tài)性的群體位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),41個群體位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05), 而其余 43個(51.2%)群體位點(diǎn)由于雜合子缺失導(dǎo)致偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。在 17個微衛(wèi)星位點(diǎn)中,Teg12、Teg17、Teg18、Teg19四個位點(diǎn)在5個群體中均沒有偏離Hardy-Weinberg平衡, Teg29、Teg37、Teg39三個位點(diǎn)在5個群體中均偏離Hardy- Weinberg平衡。

2.2 不同群體間遺傳結(jié)構(gòu)

使用Popgene 32(Version 1.31)軟件分析泥蚶5個地理群體遺傳距離及遺傳相似性指數(shù)。各群體間遺傳相似性指數(shù)以廣西群體和山東群體之間最大(0.936 5), 其次為浙江群體和韓國群體之間(0.015 9),廣西群體和韓國群體之間的遺傳相似性最小(0.842 8);相應(yīng)的, 各群體之間的遺傳距離以廣西群體和韓國群體之間最大(0.171 1), 以廣西群體和山東群體(0.065 6)、浙江群體和韓國群體之間(0.087 9)相對較小(表3)。利用MEGA6.0軟件對泥蚶 5個群體進(jìn)行聚類分析中, 獲得UPGMA聚類圖(圖1)。浙江群體和韓國群體親緣關(guān)系最近首先聚在一起, 然后與海南群體聚合; 廣西群體和山東群體親緣關(guān)系也較近,聚為一支, 然后與上面3個群體聚合。

圖1 基于泥蚶5個群體遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram based on genetic distances of five populations of T. granosa

對5個泥蚶群體進(jìn)行了F-統(tǒng)計(jì)量以及基因流分析(表 4)。5個泥蚶群體中 Teg17、Teg19、Teg34位點(diǎn)的近交系數(shù) FIS為負(fù)值, 其余位點(diǎn)的 FIS為正值;FIS值為–0.009 9～0.738 2, 平均值為0.217 4。各位點(diǎn)的總?cè)后w近交系數(shù)為 0.000 7～0.774 9, 平均值為0.264 2。度量群體間遺傳差異程度的FST為0.014 2～0.164 4, 平均值為 0.059 8, 基因流 Nm為 1.271～17.343 9, 平均值為3.927 5, 不同位點(diǎn)的基因流值變化波動較大。

利用Arlequin (version 3.1)軟件對泥蚶5個群體之間的FST分析, 結(jié)果如表5。泥蚶5個群體間的FST值在 0.012和 0.062之間, 其中韓國群體-山東群體(0.062)的FST值最高, 韓國群體-廣西群體(0.060), 海南群體-山東群體(0.051)的FST值僅次于韓國群體-山東群體。韓國群體-海南群體(0.012)、山東群體-廣西群體(0.016)的 FST值最低, 韓國群體-海南群體與山東群體-廣西群體之外的其他群體間的 FST值均達(dá)到顯著性差異。對 5個地理種群的泥蚶進(jìn)行 AMOVA分析, 結(jié)果見表 6, 發(fā)現(xiàn)種群間變異占 3.59%, 種群個體間變異占 96.41%, 結(jié)果表明引起種群總體變異的主要因素還是種群內(nèi)的遺傳變異。

表2 17個微衛(wèi)星位點(diǎn)在泥蚶5個地理群體上的遺傳多樣性分析Tab.2 Parameters of genetic diversity analyzed by seventeen loci in T. granosa five geographic populations

表3 泥蚶5個地理群體間的Nei’s遺傳相似性(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.3 Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal) among five populations of T. granosa

表4 17個微衛(wèi)星位點(diǎn)的固定指數(shù)及基因流Tab.4 Fixation index and gene flow of 17 polymorphic loci

表5 泥蚶5個群體樣本的遺傳分化系數(shù)FSTTab.5 The FST value among 5 populations of T. granosa

表6 泥蚶群體之間的AMOVA分析結(jié)果Tab.6 Analysis of AMOVA of T. granosa populations

用 IBDWS 3.23對泥蚶群體間的地理距離和遺傳距離的關(guān)系進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖2所示, 發(fā)現(xiàn)泥蚶5個群體間的遺傳分化程度和地理距離之間沒有顯著的相關(guān)性。

3 討論

3.1 泥蚶不同地理群體的遺傳多樣性分析

圖2 地理距離和遺傳距離的關(guān)系圖Fig.2 Diagram of the relationship between geographic distance and genetic distance

遺傳多樣性是物種和某個群體長期進(jìn)化的產(chǎn)物,是衡量一個種群種質(zhì)資源質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)[22]。一個種群的遺傳多樣性越高, 其對生存環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng), 進(jìn)化的潛力也越大[23]。

目前, 對于泥蚶群體的遺傳多樣性已有較多研究, 喻子牛等[24]采用水平淀粉凝膠電泳技術(shù)研究了三個泥蚶群體的等位基因酶遺傳變異, 在12種等位基因酶中共檢測到了27個基因位點(diǎn), 平均觀察雜合度為0.075, 平均有效等位基因數(shù)為1.372; 李太武等[6]采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對5個泥蚶群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究, 其平均期望雜合度為0.260 7; 呂振明等[4]采用垂直聚丙烯酰胺同工酶電泳技術(shù)對 7個泥蚶群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析, 不同群體間位點(diǎn)數(shù)為 21～28, 平均期望雜合度為0.086～0.186, 平均觀測雜合度為 0.035～0.083。本實(shí)驗(yàn)采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對 5個泥蚶群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析, 共檢測到115個不同等位基因, 5個群體的He為0.573～0.656, Ho為0.430～0.516, 明顯高于其他標(biāo)記的等位基因數(shù)和雜合度, 這與姚韓韓等[3]采用相同技術(shù)對 2個泥蚶群體的遺傳多樣性的分析結(jié)果相一致。較高的等位基因數(shù)和雜合度, 說明微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)相對于其他標(biāo)記技術(shù)可以揭示出較高水平的遺傳多樣性, 是研究物種遺傳多樣性的理想工具, 也有可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中選擇的17個位點(diǎn)均有較高的的理論多態(tài)信息含量。

17對微衛(wèi)星引物的多態(tài)信息含量為0.142～0.857,依據(jù)Botstein等[21]的劃分標(biāo)準(zhǔn), 本研究的17個位點(diǎn)中, 有5個位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn), 10個位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn), 這些微衛(wèi)星位點(diǎn)在泥蚶遺傳多樣性分析中可提供有效的信息。Teg28和Teg18的多態(tài)信息含量最低, 其中Teg28在韓國群體中為單態(tài)位點(diǎn), 分析原因可能是樣品數(shù)量不夠充足或者位點(diǎn)本身多態(tài)信息含量低, 可能在韓國群體中為保守位點(diǎn)。5個泥蚶群體的平均多態(tài)信息含量介于 0.525～0.608, 其中山東群體的平均多態(tài)信息含量最高, 為0.608; 5個群體的平均多態(tài)信息含量均處于中度偏上水平, 具有較高的遺傳多樣性水平。

群體內(nèi)Ho和He之間的平衡關(guān)系是由FIS反映的。當(dāng)FIS<0時, 說明雜合子過度; FIS>0時, 說明雜合子缺失, FIS越接近0, 說明基因型的分布越接近平衡狀態(tài)[25]。本實(shí)驗(yàn)中, FIS除了 3個微衛(wèi)星位點(diǎn)外, 其余14個位點(diǎn)均大于0, FIS的平均值為0.217 4, 說明了泥蚶群體中雜合子缺失, 海洋貝類的雜合子缺失現(xiàn)象在很多貝類中都有相關(guān)報(bào)道[26,27]。由于雜合子缺失導(dǎo)致 43個(51.2%)群體位點(diǎn)偏離 Hardy-Weinberg平衡, Yu等[27]認(rèn)為主要原因可能是無效等位基因的存在; 喻子牛等[24]認(rèn)為可能是由于近交衰退、Wahlund效應(yīng)、電泳圖譜的閱讀、自然選擇等原因造成的。

3.2 泥蚶群體的遺傳分化

遺傳距離是用來估計(jì)不同種群之間遺傳分化程度的一個指標(biāo), 根據(jù)其大小可以確定群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。群體間的遺傳距離越大, 則基因型差異越大, 表明群體間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn), 遺傳相似性越小;反之亦然[28]。本研究采用17個微衛(wèi)星位點(diǎn)對5個泥蚶群體進(jìn)行遺傳多樣性分析, 根據(jù)Nei's指數(shù)法對泥蚶 5個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行遺傳距離和遺傳相似性統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果表明廣西-山東群體遺傳相似度最大(0.936 5), 遺傳距離最小(0.065), 聚為一支。浙江-韓國群體遺傳相似度(0.915 9)僅次于廣西-山東群體,也聚為一支。海南群體與上述兩支群體間的遺傳相似度比較接近, 所以處于兩支群體之間。其中浙江-韓國群體遺傳距離比較接近, 在很多其他的研究中均有此結(jié)論[6,29], 5個群體間遺傳分化的水平的高低并不完全符合地理分布的特征, 分析原因可能是由于在泥蚶大規(guī)模養(yǎng)殖育種過程中, 不同地理群體之間互相引種[1,6], 造成不同地理群體之間交流頻繁,尤其是泥蚶養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū), 致使群體間的遺傳分化程度并不完全符合地理分布特征。

遺傳分化系數(shù) FST(F-statistic)和基因流(gene flow)是反映種群間的遺傳分化程度和各種群間基因交流情況的重要指標(biāo)[30]。當(dāng)0

鄭文娟等[7]利用 COI標(biāo)記對泥蚶地理群體進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析, 得到了我國沿海泥蚶已分化形成福建以南和以北兩大類群的結(jié)論; Ni等[8]利用COI、ITS標(biāo)記對中國東部海域和南海泥蚶類群進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析, 提出了兩個進(jìn)化顯著單元的觀點(diǎn); 邵艷卿等[32]利用 AFLP對泥蚶種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 提出未發(fā)現(xiàn)有效的南北間基因流屏障的結(jié)論; 劉春芳[33]利用 COI標(biāo)記對泥蚶 7個地理群體進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)泥蚶群體的遺傳分化主要來自于群體內(nèi)部, 與之前學(xué)者提出的南北分化且群體間的遺傳距離大于群體內(nèi)遺傳距離的觀點(diǎn)不甚相同。所以, 目前關(guān)于我國沿海泥蚶的南北區(qū)系分化的說法依然存在爭議, 分析原因可能是由于取樣的時間不同, 而且取樣數(shù)量均較少, 不能代表整個地理群體的種質(zhì)資源情況; 而且不同類型的標(biāo)記方法特點(diǎn)不同, 都具有各自的優(yōu)勢和局限性, 檢測基因組的部位也不同, 可能會導(dǎo)致結(jié)果不一樣。

本研究利用17種微衛(wèi)星標(biāo)記對泥蚶5個地理群體進(jìn)行遺傳多樣性分析, 結(jié)果顯示泥蚶 5個群體的遺傳多樣性水平較高, 種質(zhì)資源良好, 對泥蚶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的良種選育、種質(zhì)資源保護(hù)等工作具有指導(dǎo)意義。但是, 本研究中采集的泥蚶的群體數(shù)和個體數(shù)有限, 為了更好地保護(hù)泥蚶的種質(zhì)資源, 我們應(yīng)加強(qiáng)對泥蚶群體資源的遺傳學(xué)研究, 制定一套健康科學(xué)的保護(hù)措施, 保證泥蚶種質(zhì)資源得到合理和可持續(xù)性的利用。

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