李琳玲，程華，陳小玲，余海洋 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡438000；

黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃岡438000

程水源 （武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023）

SSR（Simple Sequence Repeat）又稱微衛(wèi)星序列，是重復(fù)序列的主要組成成分之一。SSR是一類由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列［1］。這些簡(jiǎn)單重復(fù)序列絕大部分隨機(jī)、均勻、廣泛地分布于真核生物的基因組上，并且由于重復(fù)次數(shù)不同而造成簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）。不同物種的SSR序列在長(zhǎng)度、組成、重復(fù)次數(shù)、突變率和在染色體上的分布情況高度多態(tài)，反映出高度的等位基因多樣性。SSR標(biāo)記由Moore等于1991年創(chuàng)立，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、涵蓋范圍廣、揭示多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，已在育種、指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建、品種鑒定及種子純度等方面得到廣泛應(yīng)用，是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一［2，3］。

我國(guó)板栗栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，在復(fù)雜的地理?xiàng)l件和氣候條件下，形成多種生態(tài)類型和地方品種［4］。湖北省羅田縣是我國(guó)重要的板栗主產(chǎn)區(qū)，栽培面積4.8萬(wàn)hm2，年產(chǎn)板栗約3.0萬(wàn)t左右，板栗產(chǎn)業(yè)系列產(chǎn)品年產(chǎn)值達(dá)4.8億元，在當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展中起著不可替代的作用［5］。板栗品種資源豐富，但對(duì)這些品種的劃分傳統(tǒng)方法主要是依據(jù)板栗的形態(tài)特征、生物學(xué)特性等來(lái)鑒別，而在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)形態(tài)相似的品種僅依靠營(yíng)養(yǎng)器官的形態(tài)特征難以在苗木期就準(zhǔn)確鑒別，且木本植物結(jié)實(shí)周期長(zhǎng)，因而不利于優(yōu)良品種的生產(chǎn)、推廣和種質(zhì)資源保存。如何準(zhǔn)確鑒別品種，及時(shí)對(duì)新品種予以審定、注冊(cè)與保護(hù)，建立準(zhǔn)確可靠的品種特異性檢測(cè)方法，對(duì)提高板栗的經(jīng)濟(jì)效益具有非常重要的實(shí)際價(jià)值［6］。

本研究以羅田遲熟板栗品種的葉片總DNA為材料，利用前期開(kāi)發(fā)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性較高的引物用于8個(gè)板栗品種的遺傳差異性分析。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得品種間的遺傳相似性矩陣，再用UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類分析樹(shù)狀圖，探討了羅田板栗種質(zhì)資源概況，以期能夠更快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地獲得板栗種質(zhì)資源的遺傳信息，從分子水平上為板栗種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為湖北省羅田縣板栗產(chǎn)區(qū)的8個(gè)栽培品種，每個(gè)品種隨機(jī)選取10～20片幼嫩葉片裝入做好標(biāo)記的自封袋中，于－40℃冰箱中冷凍保存。材料來(lái)源和編號(hào)詳見(jiàn)表1。

表1 供試板栗來(lái)源及編號(hào)

主要試劑瓊脂糖、5×TBE緩沖液、2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Maker DL2000購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；CTAB提取DNA試劑、30%聚丙烯酰胺、過(guò)硫酸胺、TEMED、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無(wú)水乙醇、冰醋酸等購(gòu)自武漢貝爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗基因組DNA的提取與檢測(cè)

參考魏春紅等［7］、程麗莉等［8］的CTAB法略做改進(jìn)，提取8個(gè)板栗品種葉片的總基因組DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，提取的總DNA保存于－20℃冰箱。

1.2.2 引物來(lái)源及SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

所用引物依據(jù)NCBI板栗EST文庫(kù)，篩選出SSR序列，參照網(wǎng)站公布的SSR引物序列，共設(shè)計(jì)出8條擴(kuò)增引物（表2），由生工生物工程有限公司合成。SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)為30μL，包括 2×Taq PCR MasterMix 反應(yīng)液（0.1UTag Polymerase／μL、500μmol／L dNTP each、20mmol／L Tris－HCl、100mmol／L KCl、3mmol／L MgCl2及其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）15μL，引物3μL，DNA模板50ng，ddH2O 9μL。擴(kuò)增程序設(shè)為94℃預(yù)變性4min；然后94℃變性30s，41～55℃退火40s，72℃3min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3min。

1.2.3 引物篩選

選用基因組DNA純度較高的板栗樣品為模板，分別對(duì)8個(gè)引物采用以上擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步分析，篩選出多態(tài)性較高的引物用于8個(gè)板栗樣品的鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將選擴(kuò)的PCR產(chǎn)物全部上樣6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在90V電壓下電泳約50min，經(jīng)硝酸銀染色，氫氧化鈉顯影，所獲得的擴(kuò)增條帶以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)。條帶統(tǒng)計(jì)以其清晰可重復(fù)為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置，有帶記為1，無(wú)帶記為0。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得品種間的遺傳相似性矩陣，再用UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類分析樹(shù)狀圖［9］。

表2 SSR分析所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 植物總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1可以看出：8份板栗葉片總DNA凝膠電泳的帶型顯示，DNA純度較高，質(zhì)量較好，可以進(jìn)行下一步的SSR－PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.2 引物篩選瓊脂糖凝膠電泳圖

隨機(jī)選取油栗的DNA為模板，分別對(duì)8條SSR擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，淘汰無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或多態(tài)性較差的引物，選留擴(kuò)增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物。根據(jù)瓊脂糖電泳得到的初步檢測(cè)結(jié)果（圖2），從中篩選出了L1、L2、L4、L6 4個(gè)引物（表3）。這些引物均能在供試板栗中擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。

圖1 總DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 引物篩選瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表3 SSR分析所用引物序列擴(kuò)增結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE電泳圖

4條引物分別對(duì)羅田8個(gè)板栗栽培品種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)統(tǒng)計(jì)共擴(kuò)增出36條DNA帶，其中多態(tài)性條帶31條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9條帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為86.1%，具體擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表3。不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)差異小。引物多態(tài)性達(dá)80%以上的 共3個(gè)，其中引物6的多態(tài)性最高，為100%。4條引物分別建立了相應(yīng)的DNA指紋圖譜，由各引物擴(kuò)增效果所反應(yīng)出的DNA條帶多態(tài)性，能較好地區(qū)分各板栗品種。

圖3 SSR－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE電泳結(jié)果

2.4 聚類分析

表4為NTSYS 2.10e軟件計(jì)算出的板栗品種間的Dice遺傳相似系數(shù)。由表4可知，8個(gè)板栗品種間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.22～0.89之間，平均遺傳相似性系數(shù)為0.65。

表4 板栗品種間Dice遺傳相似系數(shù)

在獲得兩兩不同品種間的Dice遺傳相似系數(shù)基礎(chǔ)上，以36個(gè)位點(diǎn)的譜帶為原矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建了板栗品種間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖4）。樹(shù)狀圖與品種間的遺傳相似系數(shù)反應(yīng)的情況基本一致，即遺傳相似系數(shù)越高，親緣關(guān)系越近，品種間差異就越小。從樹(shù)狀圖可以看出，在相似性系數(shù)0.35處，8個(gè)品種資源劃分成A、B 2支，B支只有羊毛栗。其余7個(gè)品種聚為A群，在相似系數(shù)0.69處A群分為A1和A2 2個(gè)亞群。A1亞群包括油栗、油栗東，從8個(gè)品種的4個(gè)SSR指紋圖譜中也可以明顯看出，這2個(gè)品種的指紋圖譜非常接近。A2亞群包括桂花香1號(hào)、桂花香2號(hào)、桂花香3號(hào)、九月寒1號(hào)、九月寒3號(hào)5個(gè)板栗品種，其中桂花香1號(hào)、桂花香2號(hào)、桂花香3號(hào)遺傳相似系數(shù)在0.89以上，九月寒1號(hào)、九月寒3號(hào)遺傳相似系數(shù)也在0.89以上，品種間的親緣關(guān)系很近?？傮w來(lái)看，8個(gè)板栗品種之間的遺傳多樣性比較豐富，SSR分子標(biāo)記可基本將其區(qū)分為2大類，羊毛栗單獨(dú)一類，其余7個(gè)品種為第二類。

圖4 基于SSR標(biāo)記以UPGMA法構(gòu)建的8個(gè)板栗品種的分子系統(tǒng)樹(shù)

3 討論

SSR標(biāo)記作為一種有效的基因型鑒技術(shù)，能夠產(chǎn)生足夠多的等位多態(tài)性，因而已成為育種系譜分析的有效手段。植物基因組中，各個(gè)SSR位點(diǎn)除重復(fù)次數(shù)不同外，其堿基組成及結(jié)構(gòu)是相似的，而且在基因組中能檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，因個(gè)體、品種（系）或群體的差異，可通過(guò)電泳、染色或分子雜交顯示出目的條帶的有無(wú)，即產(chǎn)生DNA指紋圖。同時(shí)，由于SSR在基因組中廣泛分布，因此SSR指紋圖能代表一定的基因組特征。研究DNA的差異來(lái)分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性更為直接，對(duì)正確評(píng)價(jià)植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性、制定育種策略十分重要。指紋圖譜在作物品種鑒定、親子分析、品種注冊(cè)、良種質(zhì)量監(jiān)測(cè)、分辨真假雜種、控制種子純度以及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面具有重要作用［10］。研究表明，在目前使用的絕大多數(shù)分子標(biāo)記系統(tǒng)中，SSR標(biāo)記是變異率最高的，即能檢測(cè)到的遺傳多態(tài)性較多，SSR標(biāo)記還有重復(fù)性好、特異位點(diǎn)擴(kuò)增、發(fā)生頻率高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)［11］，因而成為林木遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀基因定位以及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究的重要方法［12］。從本研究所構(gòu)建的指紋圖可以看出：共擴(kuò)增出36條DNA帶，其中多態(tài)性條帶31條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9條帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為86.1%。不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)差異小。4條引物分別建立了相應(yīng)的DNA指紋圖譜，由各引物擴(kuò)增效果所反應(yīng)出的DNA條帶多態(tài)性，能較好地區(qū)分開(kāi)各遲熟板栗品種。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新興的分子標(biāo)記技術(shù)不斷涌現(xiàn)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)也不斷得到改進(jìn)和完善［13］。SSR標(biāo)記因同時(shí)具有多態(tài)性百分率高，重復(fù)性好，共顯性等特點(diǎn)，在作物種質(zhì)資源遺傳多樣性和基因分子標(biāo)記等遺傳育種領(lǐng)域中已較廣泛應(yīng)用［10，14］。SSR標(biāo)記聚類結(jié)果為種質(zhì)資源的分類、利用和親緣關(guān)系的管理，提供了重要依據(jù)［15］。這就意味著板栗育種方面，可能會(huì)從傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)向基因育種方向，并且從表型選擇向基因型選擇方向發(fā)展。關(guān)于板栗種質(zhì)資源鑒定和管理，可能會(huì)有地域或是環(huán)境影響因素，或是地理相關(guān)趨勢(shì)，這就需要利用SSR－PCR或ISSR－PCR構(gòu)建更大范圍的板栗地理聚類結(jié)果和DNA指紋庫(kù)。

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