防感合劑的定性定量方法優(yōu)化研究

張傳仙 高驍君 倪文澎

（江蘇省中醫(yī)院藥學部，江蘇 南京 210029）

江蘇省中醫(yī)院制劑防感合劑是我院著名中醫(yī)兒科泰斗江育仁教授經(jīng)驗方，由古方桂枝加龍骨牡蠣湯并加黃芪而成。方中桂枝辛溫，甘草甘溫，二藥相合，有辛甘化陽之功，以鼓舞衛(wèi)陽；白芍味酸，與甘草合用酸甘化陰，以補營陰之不足；姜棗內(nèi)可調(diào)脾胃，外可和營衛(wèi)，脾胃健而營衛(wèi)通。龍骨、牡礪同具潛陽斂陰之功用。黃芪益氣固表，實衛(wèi)而斂汗，且具有較強的健脾之功；陳皮、白術(shù)健脾理氣。臨床用于防治小兒呼吸道感染，療效確切[1]。

作為醫(yī)院制劑，其質(zhì)量標準中，鑒別項僅對白芍所含的白芍苷進行薄層鑒別，未對處方中其他藥味進行鑒別，更沒有含量測定。實驗研究中，我們在防感合劑原標準的基礎(chǔ)上，對白芍的薄層鑒別方法進行了耐用性試驗，并增加了炙黃芪和白術(shù)的薄層色譜鑒別，用HPLC-ELSD方法對方中君藥炙黃芪中黃芪甲苷建立了含量測定方法[2]。實驗結(jié)果表明，建立的方法可靠，重現(xiàn)性好，可以更好地控制制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

凝膠成像分析儀（型號WD-9413A，北京市六一儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DHG-9123A，上海精宏實驗設(shè)備儀器廠）；醫(yī)用超聲波清洗儀，型號KQ-1000E，昆山市超聲儀器有限公司；薄層色譜展開槽、硅膠-0.5CMCNa板(自制)；Waters2695高效液相色譜儀；Alltech-2000型ELSD檢測器，電子分析天平（BP-211D型，德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

白芍對照藥材（批號120905-201109，中國食品藥品檢定研究院）；芍藥苷對照品（批號110736-201337，中國食品藥品檢定研究院）；黃芪甲苷對照品（批號110781-201314，中國食品藥品檢定研究院）；白術(shù)對照藥材（批號110786-200503，中國食品藥品檢定研究院）；防感合劑（批號1401001、1401002、1401003，江蘇省中醫(yī)院制劑部）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

防感合劑制劑處方由十一味中藥組成，原制劑薄層鑒別僅白芍一味飲片的鑒別，現(xiàn)對白芍的鑒別進行了方法學研究，并增加本制劑中炙黃芪、白術(shù)薄層色譜鑒別試驗。

2.2.1 白芍的薄層鑒別

2.2.1.1 白芍的薄層鑒別方法的建立

供試品溶液的制備：取防感合劑10ml，用正丁醇萃取兩次，每次30ml，合并正丁醇萃取液，用氨試液洗滌兩次，每次20ml，棄去氨試液，將正丁醇液水浴蒸干，殘渣加無水乙醇1ml溶解，作為供試品溶液；

陰性樣品溶液的制備：按防感合劑制備方法制備缺白芍藥材的陰性制劑，按上述方法制備陰性樣品溶液；

白芍對照藥材溶液的制備:取白芍對照藥材粉末0.5g，加乙醇10ml，振搖5分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。

芍藥苷對照品制備：取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液作為對照品溶液。

薄層層析：參照薄層色譜法（《藥典》一部附錄ⅥB） [3]，在同一硅膠G薄層板上，吸取上述三種試液各4μl分別點樣，展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2），取出，晾干，噴5%香草醛硫酸試液，105℃烘干至斑點清晰。

在硅膠G板上，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液顯相同顏色的斑點。該法分離度好，陰性樣品沒有干擾，用此法對三批樣品進行同步試驗，三批均能檢出，結(jié)果如圖1，擬建立白芍的鑒別標準。

圖1： 防感合劑中白芍薄層圖譜

2.2.1.2 白芍鑒別方法的耐用性考察[4]

2.2.1.2.1 不同薄層板的耐用性考察

取上述的供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液各4μl，分別點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠預制硅膠G上，按2.2.1.1建立的白芍薄層鑒別方法實驗，結(jié)果如圖2、圖3。從圖中可知，兩種板分離度均可，預制板中主斑點的Rf值較小，可能與制板時粘合劑的濃度有關(guān)，并沒有影響分離效果。進行了三批樣品多次實驗，重現(xiàn)性良好。

2.2.1.2.2 溫濕度對分離度的影響

取上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各4μl，分別點于兩相同來源硅膠G板上，按

圖2： 自制硅膠G板白芍薄層結(jié)果圖

圖3：預制G板白芍薄層結(jié)果圖

2.2.1.1建立的薄層鑒別條件，分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開，取出，晾干，顯色。結(jié)果如圖4、圖5。結(jié)果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好。

圖4： 25℃、50%白芍薄層鑒別結(jié)果圖

圖5： 30℃、50%白芍薄層鑒別結(jié)果圖

2.2.2 炙黃芪薄層鑒別

2.2.2.1 炙黃芪的薄層鑒別方法的建立

供試品溶液制備：取防感合劑50ml，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30ml，合并萃取液，氨試液洗滌至無色，棄去氨試液，用蒸餾水洗滌2-3次，每次30ml，將正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；

陰性樣品溶液的制備：按防感合劑制備方法制備缺炙黃芪的陰性制劑，按上述方法制備陰性樣品溶液；

對照品制備：取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作為對照品溶液。

薄層層析：參照薄層色譜法（《藥典》一部附錄ⅥB） [2]，在同一硅膠G薄層板上，吸取上述三種試液各2μl分別點樣，展開劑為三氯甲烷-甲醇-20%氫氧化鈉（13：7：2）的下層溶液，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃烘干至斑點清晰。

在硅膠G板上，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液在日光下顯相同棕褐色斑點；紫外燈光（365nm）下顯相同橙黃顏色的斑點。此方法分離度好，陰性樣品沒有干擾，用此法對三批樣品進行同步試驗，均能檢出，結(jié)果如圖6。擬建立炙黃芪的鑒別標準。

圖6 ：防感合劑炙黃芪薄層圖譜

2.2.2.2 炙黃芪鑒別方法的耐用性考察[4]

2.2.2.2.1 不同薄層板的耐用性考察

取上述供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液各2μl，分別點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠硅膠G，按2.2.2.1建立的炙黃芪薄層鑒別方法實驗，結(jié)果如圖7、圖8。從圖中可知，兩種板分離度均可，預制板中主斑點的Rf值較小，可能與制板時粘合劑的濃度有關(guān)，并沒有影響分離效果。進行了三批樣品多次實驗，重現(xiàn)性良好。

圖7： 自制硅膠G板炙黃芪薄層結(jié)果圖

圖8： 預制硅膠G板炙黃芪薄層結(jié)果圖

2.2.2.2.2 溫濕度對分離度的影響

取上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各2μl，分別點于兩相同來源的硅膠板上，按2.2.2.1建立的薄層鑒別條件,分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開，取出，晾干，顯色。結(jié)果如圖9、圖10。結(jié)果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好。

2.2.3 白術(shù)薄層鑒別

2.2.3.1 白術(shù)的薄層鑒別方法的建立

供試品溶液制備：取防感合劑50ml，用正己烷萃取兩次，每次20ml，合并萃取液，揮干，殘渣加2ml乙醇溶解，作為供試品溶液；

陰性樣品溶液的制備：按防感合劑制備方法制備缺白術(shù)的陰性制劑，按上述方法制備陰性樣品溶液；

圖9： 25℃、50%炙黃芪薄層鑒別結(jié)果圖

圖10: 30℃、50%炙黃芪薄層鑒別結(jié)果圖

對照藥材制備：取白術(shù)對照藥材粉末1g，加正己烷4ml，超聲30min，過濾，濾液作為對照藥材溶液。

薄層層析：參照薄層色譜法（《藥典》一部附錄ⅥB），在同一硅膠G薄層板上，吸取上述三種試液各10μl分別點樣，展開劑為環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（4：1：2），取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，烘干，置365nm紫外燈下檢視。

在硅膠G板上，與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液顯相同顏色的熒光斑點。此方法分離度好，陰性樣品沒有干擾，用此法對三批樣品進行同步試驗，均能檢出，結(jié)果如圖11，擬建立白術(shù)的鑒別標準。

2.2.3.2 白術(shù)鑒別方法的耐用性考察[4]

2.2.3.2.1 不同薄層板的耐用性考察

取上述的供試品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液各10μl，點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠預制硅膠G，按2.2.3.1建立的白術(shù)薄層鑒別方法實驗，結(jié)果如圖12、圖13。從圖中可知，兩種板分離度均可。進行了三批樣品多次實驗，重現(xiàn)性良好。

2.2.3.2.2 溫濕度對分離度的影響

圖11： 防感合劑白術(shù)薄層圖譜

圖12： 自制硅膠G板白術(shù)薄層結(jié)果圖

圖13： 預制G板白術(shù)薄層結(jié)果圖

上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各10μl，分別同時點于兩相同來源的硅膠G板上，按2.2.3.1建立的薄層鑒別條件，分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開，取出，晾干，顯色。結(jié)果如圖14、圖15。結(jié)果顯示，分離度較好，重現(xiàn)性好。

上述薄層鑒別方法的耐用性考察實驗結(jié)果顯示，斑點清晰，分離度好，Rf值合適，可以將白的薄層鑒別方法列為防感合劑的質(zhì)量標準。

圖14： 25℃、50%白術(shù)薄層鑒別結(jié)果圖

圖15： 30℃、50%白術(shù)薄層鑒別結(jié)果圖

2.3 定量研究

增加本制劑君藥炙黃芪中黃芪甲苷的含量測定項目，研究如下。

2.3.1色譜條件[2]

色 譜 柱：HederaC18 ODS-2（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（32：68）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.3.2 對照品溶液制備

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24h的黃芪甲苷對照品12.50mg，精密稱定，加甲醇適量，溶解，加甲醇定容置25 mL容量瓶中，制得濃度為500.00μg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品制備

取防感合劑50ml，水飽和正丁醇萃取4次，每次40mL，合并萃取液，以氨試液洗滌5次，每次約40 mL，棄去氨試液，收集正丁醇液，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備

取炙黃芪的缺味陰性制劑，按2.3.3項下的方法處理、制備炙黃芪陰性供試品溶液[1]。

2.3.5 專屬性試驗

將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液分別進樣，HPLC圖見圖16。圖中可見，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于5000，樣品基線平穩(wěn)，分離度良好，且無陰性干擾。

圖16 黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜圖

2.3.6 線性關(guān)系考察

取上述對照品溶液，分別進樣5、10、20、30、40、50 μL，依法測定峰面積。橫坐標為進樣量對數(shù)，縱坐標為峰面積對數(shù)，進行分析，得y =1.6909x + 5.1937，r =0.9991，結(jié)果表明黃芪甲苷在進樣量2.5~25 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系，如圖17。

圖17 黃芪甲苷線性關(guān)系考察

2.3.7 精密度試驗

精密吸取對照品溶液15μl，重復進樣6次，測定并計算，結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計算RSD為0.68%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號1408001），按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12 、24h進樣，進樣量為20μl，經(jīng)測定并計算，結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計算RSD為1.35%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 重復性試驗

取供試品溶液（批號1408001），分6份，進樣20μl，測定，計算，結(jié)果平均含量為：黃芪甲苷0.048 mg·mL-1，RSD以黃芪甲苷含量計算為1.13%。

2.3.10 加樣回收試驗

精密吸取已知含量的供試品溶液(批號：1408001)6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液，按2.3.3項下供試品方法配制得加樣回收的供試品溶液，進樣量為30μl，測定，計算回收率及其RSD值。結(jié)果平均回收率101.03%，RSD=0.73%值，表明方法回收率良好，準確度可靠。

2.3.11 樣品含量測定

分別取不同批號防感合劑（批號1401001、1401002、1401003），依上述方法制備成樣品供試品溶液，每批取3份，依法測定，結(jié)果見表1。

表1 三批防感合劑中黃芪甲苷含量

3 討論

3.1 方中白芍、炙黃芪的薄層鑒別方法，斑點分離度高，直觀，重現(xiàn)性好。在本試驗中，進行耐用性實驗考察了不同薄層板(青島海洋化工廠、自制硅膠G薄層板)、不同溫度(25°C、30°C)、不同濕度(相對濕度50%、70%）對薄層鑒別的影響。結(jié)果表明，上述條件的改變對防感合劑中白芍、炙黃芪、白術(shù)的薄層鑒別沒有明顯影響。白術(shù)薄層鑒別中，參考相關(guān)文獻[5-7]，展開取出晾干后，直接置于紫外燈365nm檢視，色譜斑點不清晰，故優(yōu)化方法，采用噴以10%硫酸乙醇顯色，斑點清晰，效果較好。方中防風、桂枝的薄層鑒別方法參考藥典，進行探索，但在防感合劑中鑒別點不明顯，重現(xiàn)性差，故不作為防感合劑中飲片防風和桂枝的薄層鑒別方法。

3.2 由于方中藥材種類較多，中藥飲片的成分較復雜，不同藥材，可能含有相同的化學成分。因此，僅以化學成分對照品作為參考，特別是該成分為其非專屬性成分時，難以作為飲片的定性鑒別依據(jù)。故本文建立的薄層鑒別方法白芍、白術(shù)增加對照藥材作為參考，使得薄層定性鑒別的信息更加豐富，增強了定性鑒別的準確性與可靠性。

3.3 炙黃芪作為方中君藥，其活性成分之一的黃芪甲苷也是特征性成分，具有補脾養(yǎng)血，益氣生津，可改善心肺功能，擴張血管，調(diào)節(jié)機體免疫功能等。由于黃芪甲苷，它有微弱的紫外末端吸收，不宜采用UV檢測器測其含量。DAD檢測器對皂苷類成分紫外末端吸收弱，選用ELSD作為檢測器，它能克服該缺點，適用于皂苷類成分的檢測，故現(xiàn)在多采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量[8-10]。本試驗所建立的黃芪甲苷含量測定方法，經(jīng)方法學考察表明所該法專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于防感合劑的質(zhì)量控制。

3.4 防感合劑制劑處方由十一味中藥組成，原制劑薄層鑒別僅白芍一味飲片的定性鑒別?，F(xiàn)對白芍的鑒別進行了方法學研究，建立本制劑中炙黃芪、白術(shù)薄層色譜鑒別方法和炙黃芪中黃芪甲苷的HPLC-ELSD含量測定法。以上三味藥材的薄層定性鑒別，黃芪甲苷的定量研究，經(jīng)3批樣品驗證考察，方法專屬性強、陰性無干擾，靈敏度高，重現(xiàn)性好。通過定性和定量方法兩者的結(jié)合，可以更科學、更合理、更全面地進行的質(zhì)量評價，故可作為該制劑質(zhì)量標準提高的定性依據(jù)。

[1] 袁斌,孫軼秋,韓新民,等.防感口服液治療小兒反復呼吸道感染非急性感染期60例臨床觀察[J].中國中醫(yī)急癥.2009.4（18）：519-520.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010：284.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010：96.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄131.

[5] 壽旦,俞忠明,章建民.改良的白術(shù)藥材薄層色譜鑒別研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（3）：535-536.

[6] 李艷,胡紅艷,黃秋明.白術(shù)護肝合劑中當歸、白術(shù)、芍藥的薄層色譜鑒別[J].中醫(yī)學報, 2012，27（3）：343-344.

[7] 曲婷麗,鄧亞寧,郝麗宏,等.參苓白術(shù)顆粒的薄層色譜鑒別方法研究[J].中成藥，2008，30（12）：附4-附5.

[8] 李丹.高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法檢測芪麥益氣口服液中黃芪甲苷的含量[J].醫(yī)藥導報，2010，29（7）：941.

[9] 涂興明. 高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法測定傷骨健骨膠囊中黃芪甲苷的含量[J].中藥材，2010，33（6）：999.

[10] 唐麗香. ELSD-HPLC法測定前列通膠囊中黃芪甲苷的含量[J].海峽藥學，2010，22（8）：283.