管力 白麗燕 王瑞曉 劉曉剛

(邯鄲康業(yè)醫(yī)學檢驗所 河北邯鄲 056000)

近年來,現(xiàn)代分子生物學越來越廣泛的被應用于人類疾病研究的諸領域,但試驗時經(jīng)常遇到短期內(nèi)難以得到大量的新鮮組織標本的難題,而醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織,是一個可靠的分子生物學研究的材料來源,這就需要從能長期保存的石蠟包埋的癌組織中抽提 DNA。根據(jù)現(xiàn)有的資料,從石蠟包埋組織中提取DNA的方法,一般主要包括脫蠟、消化和純化3個步驟[1-2]。普通甲醛固定石蠟包埋組織中提取質(zhì)量較差的原因有兩個,一是經(jīng)過各種理化因素刺激及殘留的酶作用后產(chǎn)生降解,二是經(jīng)過多種化學藥物作用后,組織細胞內(nèi)的變得更加脆弱,致使其在提取過程中對理化環(huán)境的變化更加敏感,更易斷裂[3]。因此對不同的提取方法及提取條件進行比較和篩選是非常有意義的。本文針對三種不同的前處理方式(切片,玻片,刮片),選擇市面上兩種試劑盒(Tiangen和Qiagen),對石蠟包埋組織提取DNA質(zhì)量進行了比較。以期達到能根據(jù)自己實驗室條件,對石蠟包埋組織進行相應的前處理和有針對性的選擇合適的提取試劑盒。

圖1 三種組織處理方式提取DNA電泳圖

1 材料與方法

1.1 標本

選取邯鄲市中心醫(yī)院2014年2月手術切除的肺癌組織,組織塊全部為癌組織,質(zhì)地均一,經(jīng)10%中性甲醛固定,12h后石蠟包埋,室溫存檔。

1.2 主要試劑和儀器

二甲苯,德國Qiagen的QIAamp DNA FFPE Tissue kit和Tiangen的TIAN quick FFPE DNA kit,天根生化DNA核酸純化試劑盒,BD 1000超微量核酸蛋白分析儀,凝膠成像系統(tǒng)(上海培清),PCR儀(美國ABI公司),測序儀(美國ABI公司),PCR Mix(Taq聚合酶,2×buffer,MgCl2,dNTP)均購自艾德萊。引物序列EGFR18:上游CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC下游GAGTTTCCC AAACACTCAGTGAAAC,400bp;EGFR19:上游CCCAGCAAT ATCAGCCTTAGGT下游GGCCAGTGCTGTCTCTAAGG,434bp;GFR21:上游CTCAGAGCCTGGCATGAAC下游GCTGC GAGCTCACCCAGAATGTCTGG,377bp由賽百盛公司合成

圖2 石蠟切片后直接用兩種試劑盒提取效果比較

圖3 石蠟組織不同前處理方式用QiaGen試劑盒提取DNA效果比較

圖4 石蠟組織不同前處理方式用TianGen試劑盒提取DNA效果比較

圖5 提取的基因組DNA完成PCR擴增后電泳圖(N為陰性對照,M為Marker,1～7道為EGFR18 PCR產(chǎn)物,400bp;8～14道為EGFR19 PCR產(chǎn)物,434bp;15～21道為EGFR18 PCR產(chǎn)物,377bp)

1.3 DNA提取方法

在提取DNA前,采取三種不同方式處理石蠟包埋組織,分別為切片機對石蠟組織連續(xù)切片;用刀片手動從石蠟組織上刮取組織,切片機切片后置于載玻片上進行烤片,形成三種石蠟組織形式:切片,刮片,玻片。提取方法按照試劑盒方法進行,并進行了適當?shù)母膭印?/p>

1.3.1 方法一:對切片形式的石蠟包埋組織用兩種試劑盒提取DNA

石蠟包埋組織用切片機連續(xù)切片,5μm厚,8張為一組,共計兩組,分別按照Qiagen和Tiangen試劑盒進行操作。

1.3.2 方法二:對刮片形式的石蠟包埋組織用Tiagen試劑盒提取DNA

用無菌刀片手動刮取2-3張石蠟組織迅速放到2ml無菌離心管中(含裂解液和脫蠟液),迅速渦旋混勻后再刮取再混勻,共刮取大約8張蠟片組織到一個離心管。之后按照Tiangen試劑盒說明進行操作。

1.3.3 方法三:對玻片形式的石蠟包埋組織用Qiangen試劑盒提取DNA

石蠟包埋組織用切片機連續(xù)切片,5μm厚,置于載玻片上60℃烤片20mins。將載玻片放在二甲苯中浸泡10mins,8張為一組,用刀片將玻片上組織刮到2ml無菌離心管中(含有1ml二甲苯),按照Qiagen試劑盒說明進行后續(xù)操作。詳細步驟同1.3.1中的Qiagen方法。其中(9)56℃水浴1h,改為56℃水浴過夜。

1.4 DNA鑒定方法

1.4.1 DNA片段長度分布

圖6 提取的基因組DNA擴增EGFR三個外顯子測序圖

以5μl DNA樣品與1μl DNA loading buffe混勻,1%瓊脂糖凝膠中200V電泳30mins,在紫外凝膠成像儀下觀察所提取DNA片段長度分布。

1.4.2 DNA純度及量的鑒定

以BD 1000超微量核酸蛋白分析儀檢測DNA樣品OD值及其濃度。

1.4.3 PCR擴增和測序

配制PCR反應體系26ul:模板DNA 2ml,上/下游引物各1ml,2×Taq Buffer 13ml,DDH2O 9ml。PCR反應條件:95℃下5mins預變性,95℃ 30s,59℃ 30s,72℃ 30s循環(huán)35次72℃延伸5mins,水代替模板DNA為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切取目的條帶,按照天根生化DNA核酸純化試劑盒進行純化,純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光標記后,ABI3100自動測序儀進行測序,,觀察提取的DNA是否可以用于直接序列測定

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA電泳圖譜

如圖1所示:不同組織處理方式,提取DNA是有差異的。從圖中可以看出1道為切片后用Tiangen試劑盒提取的DNA,片段集中分布在400bp～1500bp,2道和3道為切片后用Qiagen試劑盒提取的DNA條帶很弱;而把組織切片制作成載玻片形式后如4道和5道,再用Qiagen試劑盒提取能達到不錯的效果,片段大小集中分布于100bp～2500bp左右;對于手動刮取的組織如6道和7道,用Tiangen試劑盒也能得到片段集中分布在500bp~1500bp的DNA。

2.2 DNA濃度和純度

從圖2可以看出,石蠟切片后直接按試劑盒方法提取DNA,Tiangen試劑盒的提取結(jié)果無論從濃度和純度上都要高于Qiagen試劑盒;從圖3可以看出切片制作成玻片形式后,再按Qiagen試劑盒提取DNA,濃度和純度都要高于切片完成后直接提取的效果;從圖4可以看出,手動用刀片刮取組織按Tiangen試劑盒提取DNA純度和切片效果接近,但濃度要比切片直接做低。

2.3 PCR產(chǎn)物擴增電泳圖譜

從圖5可以看出,提取的DNA基本上能完成EGFR18(400bp),EGFR19(434bp),EGFR21(377bp)的PCR擴增,電泳圖顯示片段大小正確,目的帶清晰,效率良好。

2.4 PCR產(chǎn)物測序

將PCR產(chǎn)物純化后進行測序,從圖六可以看出,測得的長度合適,基線平穩(wěn)且峰型清晰。

3 討論

本研究從實用角度,針對石蠟包埋組織三種不同的處理方式(切片,玻片,刮片),選擇市面上兩種試劑盒(Tiangen和Qiagen),對提取DNA質(zhì)量進行了比較。以期達到能根據(jù)自己實驗室條件,對石蠟包埋組織進行相應的前處理和有針對性的選擇合適的試劑盒。

3.1 兩種試劑盒Qiagen和Tiangen提取效果

針對同樣是切片的石蠟包埋組織,從圖一和圖二可以看出,Tiangen試劑盒無論從濃度還是純度上都要高于Qiagen試劑盒,這可能是由于Tiangen采用的是高溫98℃同時進行脫蠟和蛋白酶消化,脫蠟和消化比較徹底;而Qiagne試劑盒是二甲苯脫蠟,脫蠟離心后去除上清時,容易吸到組織,因為離心完成后,并沒有像試劑盒描述的那樣,組織沉到管底,而是懸浮于離心管中,這種情況可能是由于脫蠟不夠徹底,因石蠟可阻礙消化液對組織的滲透,從而抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白的接觸,影響組織消化和DNA釋放,在DNA提取過程中,如未能有效去除石蠟,形成DNA-石蠟混合液,不利于PCR擴增蛋白酶K消化[4]。也可能因此導致了對切片形式的石蠟包埋組織,用Qiagen試劑盒提取DNA濃度和純度比Tiangen低。

3.2 Qiagen試劑盒對切片和玻片形式的石蠟包埋組織提取DNA效果

從圖1和圖3可以看出無論是純度還是濃度,玻片形式都要比切片形式高很多,且DNA片段分布范圍更寬廣。這可能是由于玻片形式的石蠟包埋組織在按照試劑盒提取之前多了一道二甲苯浸泡玻片操作,脫蠟的效果更徹底,而且在試驗中我們也明顯看到,離心之后,相比切片形式的組織懸浮在二甲苯中,玻片形式組織離心后已經(jīng)沉入到了離心管底。而且玻片形式的在操作中將90℃水浴1h改為了90℃過夜,蛋白酶K消化時間的延長,減少了蛋白的污染,使DNA純度提高。消化時間是一個在學術界尚無定論的問題,有人認為消化時間應適當延長,最長者有報道經(jīng)7天消化,可產(chǎn)生高質(zhì)量的DNA[5];Isola等認為增加蛋白酶 K消化,能明顯增加大分子量的DNA產(chǎn)量,這可能與蛋白酶 K 消化能部分逆轉(zhuǎn)由固定導致的交聯(lián)現(xiàn)象有關[6],但也有研究表明: 長時間蛋白酶K 消化,使短片段增加[7]。從我們實驗中,我們也發(fā)現(xiàn)玻片形式組織延長消化時間后,片段分布范圍更寬廣。

3.3 Tiangen試劑盒對切片和刮片形式的石蠟包埋組織提取DNA效果

從圖一和圖四中可以看出切片形式和刮片形式包埋組織提取的DNA純度差異不大,但刮片形式濃度比切片形式低,這可能跟手動刮取的石蠟包埋得組織量少有關。

4 結(jié)論

根據(jù)各自實驗室條件和樣本來源,如果樣本已經(jīng)是烤過片的玻片形式的石蠟包埋組織,可以選擇改良的Qiagen試劑盒提取DNA(提取前增加一步二甲苯浸泡玻片脫蠟,試驗中90℃水浴1h改為90℃過夜); 而樣本如果是石蠟塊包埋的組織,有切片機的,可以將石蠟包埋組織切成5um厚切片,8張為一組,用Tiangen試劑盒提取DNA;而沒有切片機的實驗室可以選擇用刀片刮取石蠟塊組織,刮盡量薄的組織片,大約8張為一組,用Tiangen試劑盒提取DNA。得到的DNA都可以滿足后續(xù)PCR擴增及測序要求。

[1]Satoy,Sugier,TsuchiyaB,etal.Comarison of the DNA extraction methods for polymerase chain reaction amplification from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.[J].Diagn Mol Paehol,2001,10(4):265.

[2]BielawskiK,Zaczed,LisowskaU,etal.Thesuitability of DNA extracted from formalin-fixed,Paraffin-embdded tissues for double differential polymerase chain reaction analysis.[J].Int JMol Med,2001,8(5):573.

[3]Mies C,Houldsworth J.Chaganti RS.Extraction of DNA from paraffin blocks for Southern bolt analysis.[J].Am J Surg Pathol,1991,15(2):169-174.

[4]石蠟包埋組織基因組DNA提取的條件優(yōu)化,臨床與試驗病理學雜志,J Clin Exp Pathol,2011,Sep;27(9):1021-1023.

[5]Warford A,Pringle JH,Hay J,et al.Southern blot analysis of DNA extracted from formal-saline fixed and paraffin wax embedded tissue[J].J Pathol,1988,154(4):313-320.

[6]Isola J,DeVries S,Chu L,et al.Analysis of changes in DNA sequence copy number by comparative genomic hybridization in archival paraffin-embedded tumor samples.Am J Pathol;1994,145:1301-1308.

[7]Lonn U,Lonn S,Nilsson B,et al.Demonstration of gene-amplification by PCR in archival paraffin-embedded breast cancer tissue.Breast Cancer Res Treat,1994;30:147-152.