汪靈芝，彭建新，陶亮，黃煥森

1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510260；

2.廣東省中醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510120；

3 中山大學中山醫(yī)學院藥理學，廣東 廣州 510080

依托泊苷是一種細胞周期特異性抗腫瘤藥物，主要作用于細胞的S期和G2期，通過抑制細胞內DNA拓撲異構酶Ⅱ的連接修復功能，使得DNA拓撲異構酶Ⅱ與已經斷裂的DNA單鏈和雙鏈形成具有破壞性的酶-DNA斷裂復合物，從而導致腫瘤細胞的凋亡或死亡。依托泊苷是廣泛應用于白血病、淋巴瘤、睪丸癌及膀胱癌治療的一線化療藥物［1-2］。腫瘤患者常常需要進行長期的化療，但依托泊苷所帶來的嚴重的骨髓抑制和消化道等不良反應大大限制了其臨床應用［3］。因此，尋找能夠增強依托泊苷抗腫瘤作用的方法或者策略將具有重要的意義。

細胞縫隙連接(gap junction，GJ)是直接溝通相鄰細胞胞質的一種蛋白質連接通道。6個穿越細胞膜的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)環(huán)繞在一起形成半通道，位于相鄰細胞膜上的2個半通道對接形成完整的GJ。相鄰細胞通過GJ所介導的縫隙連接通訊進行能量物質以及信號分子的傳遞，進而調控細胞的生長、增殖和分化。有研究［4-5］表明，GJ可以增強X線照射以及順鉑等化療藥物的細胞毒性。但人體組織中表達最豐富的Cx43所組成的GJ是否影響依托泊苷的抗腫瘤作用仍鮮見報道。因此，本研究擬通過藥物和分子生物學手段改變睪丸癌細胞MLTC-1細胞上Cx43所組成的GJ功能，觀察其對依托泊苷細胞毒性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

本研究所使用的MLTC細胞和Cx43-siRNA穩(wěn)定轉染細胞株由中山大學陶亮教授實驗室提供。本研究中的主要試劑：胎牛血清，青-鏈霉素，胰酶和MEM干粉等細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；全反式維甲酸(retinoid acid，RA)和18-α-甘草次酸(glycyrrhetinic acid，18-α-GA)等試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 睪丸癌MLTC細胞的培養(yǎng)

培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%的胰蛋白酶消化法進行傳代，1周傳代2～3次，傳代比例約為1∶3。實驗前將細胞培養(yǎng)24～48 h，使其表達形成有效的GJ。

1.2.2 細胞接種熒光示蹤法［6］檢測MLTC-1細胞的GJ熒光傳遞功能

取對數生長期細胞，以1.0×105/mL接種于6孔板。隨機分為對照組、50 μmol/L 18-GA處理組、20 μmol/L RA處理組進行處理。將表達有Cx43的細胞與熒光指示劑calcein-AM和DiI-CM共同溫育，使calcein-AM和DiI-CM進入細胞，該細胞稱為“供體細胞”。將“供體細胞”接種到接受過18-GA(1 h)和RA(24 h)并已生長融合的睪丸癌細胞(“接受細胞”)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，記錄一個“供體細胞”周圍含有calcein的“接受細胞”作為GJ功能指標。

1.2.3 標準細胞集落形成分析法［7］測定依托泊苷的細胞毒性

采用標準細胞集落形成分析法，以細胞集落形成率的降低作為依托泊苷的細胞毒性指標，測定依托泊苷對天然表達Cx43的睪丸癌MLTC-1細胞集落形成的影響。在表達Cx43且有GJ形成的細胞加入6 μmol/L依托泊苷，作用1 h后，PBS清洗細胞，每組取500個細胞重新接種于培養(yǎng)板7 d后測定細胞集落形成率，通過計數細胞集落形成率比較依托泊苷毒性大小。細胞集落形成率=依托泊苷處理組的細胞集落數/未用依托泊苷的細胞集落數。在上述GJ形成細胞，分別加入18-GA和RA提前預處理細胞1 h和24 h，再聯合依托泊苷處理細胞1 h，同樣的方法計數細胞集落形成率以此觀察藥物改變Cx43組成的GJ功能對依托泊苷細胞毒性的影響。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。2組間計量資料比較采用t檢驗，多組間計量資料比較采用ANOVA分析，組間比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計圖表采用Sigma Plot 10.0 繪制。

2 結 果

2.1 18-GA、維甲酸和Cx43干擾RNA對睪丸癌細胞熒光傳遞功能的影響

細胞接種熒光實驗結果顯示，50 μmol/L 18-GA作用MLTC-1細胞后，供體細胞周圍的接受細胞數明顯<對照組，熒光傳遞功能約為對照組的(24±3)%(t=23.04，P<0.01)；而與之相對應的是，20 μmol/L維甲酸處理細胞24 h后，供體細胞周圍的接受細胞數明顯多于對照組，熒光傳遞功能約為對照組的(143±8)%(t=-4.74，P<0.01)。Cx43 siRNA穩(wěn)定轉染細胞與正常對照組細胞相比，供體細胞周圍的接受細胞數明顯減少，熒光傳遞功能為對照組的(15±2)%(t=42.15，P<0.01)。結果證明，18-GA和Cx43 siRNA可以降低由Cx43所組成的GJ熒光傳遞功能，而維甲酸能夠增強Cx43組成的GJ功能(圖1)。

圖1 不同藥物和Cx43干擾RNA對睪丸癌細胞縫隙連接熒光傳遞功能的影響 Fig. 1 The effect of chemicals and siRNA on the dye spread of MLTC-1 cells assayed by parachute assay

2.2 18-GA和維甲酸對依托泊苷細胞毒性的影響

細胞集落形成實驗結果顯示，在表達Cx且形成GJ的MLTC-1細胞中，18-GA與依托泊苷聯合應用組的細胞集落形成率高于單用6 μmol/L依托泊苷組(t=-4.88，P<0.01)。這表明，18-GA抑制GJ后，依托泊苷的細胞毒性明顯降低。同時我們的結果還顯示，維甲酸與依托泊苷聯合應用組的細胞集落形成率低于單用依托泊苷組(t=7.14，P<0.01)，表明維甲酸增強GJ功能可增加依托泊苷的細胞毒性(圖2) 。

2.3 Cx43干擾RNA對依托泊苷細胞毒性的影響

細胞集落形成實驗結果顯示，在穩(wěn)定轉染Cx43 siRNA的細胞中，加入6 μmol/L依托泊苷后，細胞集落形成率明顯高于正常對照組細胞(t=-3.22，P<0.05)。結果證明Cx43 siRNA降低Cx43組成的GJ功能后依托泊苷的細胞毒性明顯降低(圖3)。

圖2 18-GA和RA對依托泊苷抑制睪丸癌細胞增殖的影響Fig. 2 The effect of 18-GA and RA on etoposide cytotoxicity in MLTC-1 cells expressing Cx43

圖3 轉染或者未轉染Cx43-siRNA對依托泊苷抑制睪丸癌細胞增殖的影響Fig. 3 Etoposide cytotoxicity in MLTC-1 cells transfected with or without Cx43-siRNA

3 討 論

本研究通過應用藥物和分子生物學手段改變睪丸癌細胞GJ功能系統(tǒng)研究了依托泊苷抗腫瘤作用與Cx43所組成的GJ的關系，首次證實了Cx43組成的GJ介導了依托泊苷對睪丸MLTC-1癌細胞增殖的抑制作用。細胞集落結果顯示，18-GA抑制Cx43組成的GJ功能，降低了依托泊苷細胞毒性；而維甲酸增強Cx43組成的GJ功能，增加依托泊苷細胞毒性。由此可見，調控GJ的功能，能夠改變依托泊苷的抗腫瘤作用。本研究結果提示，利用分子生物學和化學藥物提高細胞間間隙連接通訊功能能夠顯著提高睪丸癌細胞對依托泊苷的敏感性，并有望降低其耐藥性的產生。因此，睪丸癌細胞上針對Cx43為靶點的藥物開發(fā)和治療策略將對改善化療療效和安全性具有重要的意義。

人體組織中已經發(fā)現有21種Cx，其中Cx43在人體多種組織細胞中都有表達，是分布最廣泛的一種GJ蛋白。在培養(yǎng)的腫瘤細胞，Cx43組成的GJ能夠顯著增強多種化療藥物的細胞毒性。研究者發(fā)現，由Cx43所組成的GJ能夠顯著增強順鉑對小鼠永生型成纖維干細胞(MEFs)的毒性，而細胞轉染Cx43 RNAi后順鉑毒性明顯下降［7］。轉染Cx43可以增強前列腺癌細胞的縫隙連接通訊，提高其對TNF-α的敏感性［8］。我們的實驗結果證實依托泊苷對睪丸癌細胞增殖的抑制作用在Cx43組成的GJ存在的情況下明顯增高，與前述的研究結果相吻合［7］。

GJ增強化療藥物細胞毒性的機制與“旁觀者效應”有關。旁觀者效應最早是在自殺基因治療腫瘤研究中發(fā)現，研究人員發(fā)現，有部分腫瘤細胞轉染自殺基因后，可引起強大的抑制腫瘤生長的效應，包括被轉染細胞以及周圍未被轉染細胞均被殺滅。轉染Cx基因的腫瘤靶細胞中的HSV-TK/GCV的治療要比未轉染Cx基因的作用要強，這說明GJ提高了HSV-TK/GCV基因治療的旁觀者效應，實驗者認為鳥嘌呤的三磷酸代謝物通過由于Cx43構成的GJ從有自殺基因的細胞擴散到周圍無自殺基因的細胞，引起細胞死亡［9］。同樣地，類似的旁觀者效應也出現在腫瘤的放療和化療領域［10］。Jensen等［7］研究人員發(fā)現順鉑在誘導細胞凋亡的同時也很可能產生了一種“死亡信號”，死亡信號通過相鄰細胞間的GJ傳遞，導致單個細胞內死亡信號的放大從而增強了順鉑的細胞毒性。

與順鉑相似，依托泊苷也是通過干擾DNA的復制抑制腫瘤細胞的生長增殖。依托泊苷抑制細胞內DNA拓撲異構酶Ⅱ的連接修復功能，使得DNA拓撲異構酶Ⅱ與已經斷裂的DNA單鏈和雙鏈形成具有破壞性的酶-DNA斷裂復合物，復合物激活細胞內包括ATM、ATR分子參與的修復系統(tǒng)及細胞周期調控系統(tǒng)，一旦損傷未修復或者錯誤修復，將會介導染色體的重排和周期停滯，最終導致細胞凋亡或者死亡。因此，我們推測，順鉑和依托泊苷這2種針對DNA復制的化療藥物在誘導細胞凋亡的過程中所激活的修復或者損傷通路有著某些相似之處。研究中依托泊苷作用細胞1 h，極有可能會引起一些類似的細胞周期蛋白，凋亡相關蛋白及其DNA損傷相關的蛋白或者死亡信號發(fā)生改變，有研究認為可能是能通過GJ擴散的小分子細胞內信使物質如IP3、Ca2＋等［11-12］。我們前期針對MLTC-1細胞的相關研究也證實，DNA交聯物在縫隙連接所介導的順鉑毒性中具有重要的作用［13］，但其是否介導依托泊苷所誘導的死亡信號的傳遞還有待證實。

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