鄭驚雷，梁力建，王在國，黃文靜，王雪丁

1.廣東省東莞市人民醫(yī)院腫瘤外科，廣東 東莞 523059；

2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080；

3.廣東省藥品檢驗(yàn)所抗生素室，廣東 廣州 510180；

4.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510080

經(jīng)不同途徑區(qū)域灌注氟尿嘧啶在肝癌、肝組織及血漿中的濃度差異

鄭驚雷1，梁力建2，王在國1，黃文靜3，王雪丁4

1.廣東省東莞市人民醫(yī)院腫瘤外科，廣東 東莞 523059；

2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080；

3.廣東省藥品檢驗(yàn)所抗生素室，廣東 廣州 510180；

4.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510080

背景與目的：肝動脈、肝門靜脈灌注區(qū)域化療是肝癌的重要治療手段，本研究探討區(qū)域性灌注化療時(shí)氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)在大鼠肝癌和肝臟組織及血漿中的分布，為臨床肝臟腫瘤化療提供參考。方法：將24只荷瘤大鼠隨機(jī)分為4組，分別經(jīng)外周靜脈(尾靜脈)、肝動脈、肝門靜脈或結(jié)扎肝動脈后經(jīng)肝門靜脈灌注5-FU，劑量為20 mg/kg。采用高效液相色譜法測定肝癌、肝臟組織及血漿中5-FU的含量，并計(jì)算藥物在血漿、肝臟和肝癌組織間的穿透比率。結(jié)果：結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈組5-FU濃度在肝臟和肝癌組織中最高，分別為(22.1±9.5)μg/g和(16.4±7.2)μg/g；其次為肝動脈組；肝門靜脈組5-FU濃度在肝癌組織中的濃度較低，為(8.9±3.7)μg/g；外周靜脈組5-FU濃度在肝臟和肝癌組織中的藥物濃度均為最低，肝癌組織中的濃度僅為(4.3±2.2)μg/g。在血漿中的5-FU濃度正好相反，外周靜脈組濃度最高(26.8±12.5)μg/mL，肝動脈組(16.4±9.7)μg/mL、結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈組(15.9±10.1)μg/mL和肝門靜脈組(14.9±8.5)μg/mL等3組濃度相近，均明顯低于外周靜脈組(P<0.05)。5-FU的肝癌/血漿穿透比率依次為結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈組(103.47%)，肝動脈組(92.94%)，肝門靜脈組(59.58%)和外周靜脈組(16.08%)。結(jié)論：與外周靜脈注射全身化療比較，區(qū)域性灌注化療可顯著提高肝癌和肝臟組織中的藥物濃度，同時(shí)減少化療藥物在外周血中的分布，其中經(jīng)結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈灌注和經(jīng)肝動脈灌注是肝癌區(qū)域性化療2種較好的途徑。

氟尿嘧啶；肝癌；區(qū)域化療；穿透比率

肝癌全身化療效果不理想，有效率不足20%。肝動脈和(或)肝門靜脈灌注區(qū)域化療常作為肝癌術(shù)后治療和不能切除的晚期肝癌治療的重要手段，以實(shí)現(xiàn)藥物在癌灶和靶組織器官中達(dá)到高濃度，并減少外周血和其它組織器官中藥物分布、降低不良反應(yīng)的目的［1-2］。本研究在既往研究［3］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究和比較分別在外周靜脈注射和不同途徑的區(qū)域性灌注下，肝癌和肝臟組織及血漿中的藥物分布規(guī)律和差異，探討區(qū)域性灌注化療對肝癌的化學(xué)治療作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性BALB/c裸鼠2只，體質(zhì)量17.1～19.6 g，作種鼠供皮下接種腫瘤細(xì)胞株用，雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量(120±15) g，供肝內(nèi)種植腫瘤用；均為SPF級，由中山大學(xué)動物中心提供。動物實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按動物倫理規(guī)范進(jìn)行。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞株

大鼠CBRH-7919肝癌細(xì)胞株，由中山大學(xué)細(xì)胞保藏中心提供。

1.1.3 藥品

氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)，南通精華制藥有限公司生產(chǎn)，批號：070402，規(guī)格10 mL： 0.25 g。5-FU對照品：南通精華制藥有限公司提供，批號：02005098。

1.1.4 儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 486紫外檢測器，Waters 510泵，SCL進(jìn)樣器，三銳色譜工作站；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；飛鴿TGL-16C臺式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；微量采樣器(上海求精生化試劑廠)；0.45μm微孔濾膜(天津騰達(dá)過濾器件廠)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠移植性肝癌模型的建立

參照程文等［4］的方法并加以改進(jìn)，將培養(yǎng)好的CBRH-7919肝癌細(xì)胞懸液在無菌條件下注射于2只裸小鼠背部皮下，每只注射0.2 mL (約5×106個細(xì)胞)。2周后長成直徑1.5 cm大小的腫瘤，麻醉后在無菌條件下取出腫瘤，選擇邊緣的乳白色癌組織，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤塊。大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛0.3 mg/100 g腹腔注射麻醉后固定，消毒后在無菌條件下取劍突下正中切口打開腹腔。選擇肝左葉，以穿刺針在肝包膜下斜形作一深約8 mm的隧道，將預(yù)先裝在針芯內(nèi)的瘤塊緩慢推出植入肝內(nèi)，用小塊明膠海綿封閉創(chuàng)口。手術(shù)當(dāng)天始連續(xù)5 d腹腔注射氫化可的松2 mg/只抑制免疫。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

造模2周后，將荷瘤大鼠24只用簡單隨機(jī)抽樣法分為4組，每組6只。①外周靜脈組：經(jīng)尾靜脈注射給藥；②肝動脈組：經(jīng)胃十二指腸動脈插管至肝動脈給藥；③肝門靜脈組：經(jīng)胃網(wǎng)膜靜脈插管至肝門靜脈給藥；④肝動脈結(jié)扎的肝門靜脈組：先行肝動脈結(jié)扎后經(jīng)肝門靜脈給藥。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg體質(zhì)量。

1.2.3 肝動脈和門靜脈插管方法

肝動脈組大鼠開腹后，分離出胃十二指腸動脈、肝總動脈及肝固有動脈。用動脈夾暫時(shí)阻斷肝總動脈，在胃十二指腸動脈遠(yuǎn)端插入外徑約0.5 mm的自制導(dǎo)管到肝固有動脈開口處，確認(rèn)管腔通暢后(松開動脈夾，可以看到導(dǎo)管內(nèi)血液波動)，前端用已經(jīng)套好的絲線結(jié)扎并固定，按體質(zhì)量注入稀釋于0.9%NaCl溶液的5-FU注射液后結(jié)扎胃十二指腸動脈。同法，對肝門靜脈組大鼠行胃網(wǎng)膜靜脈插管經(jīng)腸系膜上靜脈至肝門靜脈給藥。

1.2.4 標(biāo)本采集

大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，按上述不同途徑注射5-FU，給藥后10 min經(jīng)下腔靜脈取血2 mL，置于已肝素化的聚乙烯塑料管，1 400×g離心20 min取血漿，-20 ℃低溫保存；同時(shí)剝離肝臟腫瘤并切取癌旁肝臟組織約2 g，用0.9%NaCl溶液清洗后，置于玻璃研缽中研磨成勻漿，-20 ℃低溫保存，備用。

1.2.5 測定5-FU濃度［5］

采用高效液相色譜法(HPLC)測定大鼠血漿、肝癌和肝臟組織中5-FU的濃度。①標(biāo)本處理：取0.2 mL血漿或全部肝臟(或腫瘤)組織勻漿，加1 mL乙酰乙酯旋渦振蕩5 min，5 600×g離心10 min，吸取上清液于試管中，用氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動相溶解，取20 μL進(jìn)樣測定；②HPLC色譜條件：色譜柱為Kromasil 100A C18柱(5 μ，250 mm×4.6 mm，迪馬公司)；流動相為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液、流速為1 mL/min；紫外檢測波長為265 nm；進(jìn)樣量20 μL。使用三銳色譜工作軟件記錄色譜峰，自動計(jì)算峰面積；③制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取大鼠空白血漿0.2 mL或2 g空白肝臟的勻漿液，加入不同濃度的5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)上述方法測定，以相應(yīng)的藥物濃度對色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，得血漿和肝臟組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。①不同給藥途徑下5-FU區(qū)域灌注化療時(shí)肝癌、癌旁肝臟組織和血漿中的藥物濃度分布數(shù)據(jù)用±s表示。各組之間計(jì)量資料比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②計(jì)算穿透比率(PR)：PRLP=CL/CP，PRCP=CC/CP，PRCL=CC/ CL；PRLP為化療藥物在肝臟-血漿的穿透比率，PRCP為肝癌-血漿的穿透比率，PRCL為肝癌-肝臟組織的穿透比率；CP為血漿藥物濃度，CL為肝臟組織藥物濃度，CC為肝癌組織藥物濃度。

2 結(jié) 果

2.1 藥物在肝癌、癌旁肝臟組織和血漿中的濃度分布

大鼠經(jīng)不同途徑灌注化療藥物5-FU后，藥物在肝癌、癌旁肝臟組織和血漿中的分布具有顯著的差異。外周靜脈組的血漿5-FU濃度最高，達(dá)(26.8±12.5)μg/mL，而癌旁肝臟組織和肝癌中的藥物濃度均為最低，癌灶中的濃度僅為(4.3±2.2)μg/g。結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈組的藥物濃度在癌旁肝臟組織和肝癌中最高，分別為(22.1±9.5)μg/g和(16.4±7.2)μg/g；其次為肝動脈組，癌旁肝臟組織和肝癌中的濃度均稍低于前者；肝門靜脈組在肝癌中的濃度較低，為(8.9±3.7)μg/g。5-FU在上述3組中的血漿濃度分別為(15.9±10.1)，(16.4±9.7)和(14.9±8.5) μg/mL，均顯著低于外周靜脈組，而3組之間的血藥濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2 5-FU經(jīng)不同途徑灌注給藥后的穿透比率

經(jīng)不同途徑灌注5-FU后，結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈組的穿透比率最高，藥物在肝臟/血漿、肝癌/血漿和肝癌/肝臟間的穿透比率分別為139.19%、103.47%和74.33%；肝動脈組的穿透比率稍低；肝門靜脈組肝癌/血漿的穿透比率為59.58%，遠(yuǎn)低于前2組，而外周靜脈組的肝臟/血漿和肝癌/血漿穿透比率最小，分別為35.26%和16.08%(表2)。

表1 5-FU經(jīng)不同途徑給藥后在大鼠肝臟、癌旁肝臟組織和血漿中的濃度分布Tab. 1 Distribution of 5-FU in rat hepatoma, liver tissue and plasma after different routes of administration

表2 5-FU經(jīng)不同途徑灌注后在大鼠肝臟中的穿透比率Tab. 2 The penetration rates of 5-FU in the rats livers through different routes of administration

3 討 論

化療藥物殺滅或抑制癌變部位的腫瘤細(xì)胞，是通過在癌灶內(nèi)達(dá)到和維持一定的藥物濃度所產(chǎn)生的化學(xué)作用來實(shí)現(xiàn)的。要達(dá)到較好的化療效果，應(yīng)符合以下基本條件：①癌細(xì)胞要對化療藥物敏感；②藥物在癌灶或靶組織器官中有較高濃度；③藥物的不良反應(yīng)小，盡可能經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。目前，化療是肝癌除手術(shù)以外一項(xiàng)重要的治療措施，肝癌全身化療效果不理想，有效率不超過20%。區(qū)域性灌注化療是目前常采用的化療方法，用于預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和不能切除的晚期肝癌的治療［6-7］。

5-FU在現(xiàn)有化療藥物中是對肝癌療效較好的藥物，且不良反應(yīng)小、價(jià)格便宜，是目前肝癌化療最常用的藥物［8］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)肝動脈、肝門靜脈和結(jié)扎肝動脈后的肝門靜脈3種途徑區(qū)域性灌注化療后，5-FU在癌旁肝臟組織和肝癌中的濃度分別為19.92～22.09 μg/g和8.86～16.42 μg/g，均顯著高于經(jīng)外周靜脈注射全身化療(9.45和4.31 μg/g)。相反，經(jīng)外周靜脈注射全身化療時(shí)，5-FU的血漿藥物濃度高達(dá)26.80 μg/mL，明顯高于其它3個區(qū)域灌注化療組的血藥濃度(肝動脈組16.44 μg/mL，肝門靜脈組14.87 μg/mL和結(jié)扎肝動脈后的肝門靜脈組15.87 μg/mL)。從5-FU的穿透比率也可以看出，3組區(qū)域性灌注化療的肝臟/血漿和肝癌/血漿的穿透比率分別為132.79%～139.19%和59.58%～103.47%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外周靜脈注射全身化療?？梢?，區(qū)域灌注化療可顯著提高肝臟和腫瘤中的藥物濃度、增加肝癌化療效果，同時(shí)顯著減少化療藥物在外周血中的暴露、降低藥物的不良反應(yīng)。

經(jīng)肝動脈、肝門靜脈和結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈3種不同途徑對肝癌進(jìn)行區(qū)域性灌注化療，藥物在肝臟和血漿中的分布差異不大，這與我們既往的研究結(jié)果一致［3］，但肝癌組織中的藥物濃度存在較大的差異。經(jīng)結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈和經(jīng)肝動脈灌注化療藥物時(shí)，5-FU在癌灶中的濃度顯著大于單純經(jīng)肝門靜脈注射。原因可能是肝臟接受肝動脈和肝門靜脈雙重供血，肝臟從肝動脈血和肝門靜脈血中攝取氧量約各占一半，故經(jīng)肝動脈或肝門靜脈灌注化療藥物時(shí)，5-FU在肝臟組織中的濃度差異不大；而肝癌的血液供應(yīng)90%～95%來自肝動脈，肝門靜脈供血只占很少的比例，因此，經(jīng)肝動脈灌注時(shí)肝癌的藥物濃度明顯大于經(jīng)肝門靜脈灌注。結(jié)扎肝動脈后，肝門靜脈血成為包括肝癌在內(nèi)的整個肝臟的唯一血液供應(yīng)來源，經(jīng)肝門靜脈灌注的化療藥物得以大量進(jìn)入癌灶內(nèi)。同時(shí)有研究表明［9-10］，肝癌的血管并不與肝動脈直接溝通，而是與瘤體的末梢肝門靜脈和肝竇相通，藥物是經(jīng)這些吻合支進(jìn)入腫瘤組織的，這也可能是結(jié)扎肝動脈后肝門靜脈灌注5-FU在肝癌病灶中的濃度和穿透比率較單一的門靜脈灌注時(shí)得以顯著提高的緣故。

綜上所述，區(qū)域性灌注化療可通過有效提高肝癌和肝臟中的藥物濃度而增加化療效果，同時(shí)顯著減少藥物在外周血中的分布、降低毒副作用，其中經(jīng)結(jié)扎肝動脈的肝門靜脈灌注和經(jīng)肝動脈灌注是肝癌區(qū)域性灌注化療的2種較好途徑。

［1］ CAGOL P P, PASQUAL E, BACCHETTI S. Potential advantages of loco-regional intra-arterial chemotherapy［J］. In Vivo, 2006, 20(6A): 777-779.

［2］ KIRCHHOFF T D, BLECK J S, DETTMER A, et al. Transarterial chemoembolization using degradable starch microspheres and iodized oil in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma: evaluation of tumor response, toxicity, and survival［J］. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2007, 6(3): 259-266.

［3］ 鄭驚雷, 梁力建, 胡文杰, 等. 區(qū)域性灌注化療時(shí)5-FU的血液和肝臟組織藥物濃度分布特征［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(5)：823-827.

［4］ 程文, 張青萍, 貢雪灝, 等. 超聲監(jiān)護(hù)下免疫抑制大鼠肝癌模型的建立［J］. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2003, 19(7): 840-842.

［5］ 谷元, 陸榕, 司端運(yùn), 等. Determination of 5-fluorouracil in human plasma by high-performance liquid chromatography (HPLC)［J］. 天津大學(xué)學(xué)報(bào)(英文版), 2010, 16(3):167-173.

［6］ SCHWARTZ M, ROAYAIE S, KONSTADOULAKIS M. Strategies for the management of hepatocellular carcinoma［J］. Nat Clin Pract Oncol, 2007, 4(7): 424-432.

［7］ LIANG H L, HUANG J S, LIN Y H, et al. Hepatic arterial infusion chemotherapy for advanced hepatocellular carcinoma by placing a temporary catheter via the subclavian route［J］. Acta Radiol, 2007, 48(7):734-740.

［8］ WADA H, NAGANO H, NODA T, et al. Complete remission of hepatocellular carcinoma with portal vein tumor thrombus and lymph node metastases by arterial infusion of 5-fluorouracil and interferon-alpha combination therapy following hepatic resection［J］. J Gastroenterol, 2007, 42(6):501-506.

［9］ 高潔, 張華, 趙化榮, 等. 新疆地區(qū)246例維吾爾族原發(fā)性肝癌預(yù)后因素及療效分析［J］. 中國癌癥雜志, 2013, 23(5): 362-369.

［10］ VOBORIL R. Blood supply of metastatic liver tumors: an experimental study［J］. Int Surg, 2005, 90(2):71-77.

Distribution of 5-FU in rat hepatoma, liver tissue and plasma after locoregional infusion

ZHENG Jinglei1, LIANG Lijian2, WANG Zaiguo1, HUANG Wenjing3, WANG Xueding4(1. Department of Oncosurgery, Dongguan People’s Hospital, Dongguan Guangdong 523059, China; 2.Department of Hepatobiliary, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong 510080, China; 3. Guangdong Institute of Drug, Guangzhou Guangdong 510180, China; 4. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong 510080, China)

ZHENG Jinglei E-mail: jlzheng@126.com

Background and purpose:Locoregional infusion chemotherapy such as hepatic artery, or hepaticportal vein infusion is one of the most important treatments for hepatocelluar carcinoma. This study was aimed to investigate the distribution of fluorouracil(5-FU) in rat hepatoma, liver tissue and plasma after administrated by caudal vein or locoregional routes of hepatic artery, hepaticportal vein, and hepaticportal vein with ligated hepatic artery.Methods:Twenty-four tumor-bearing rats were divided into 4 groups randomly, and they were infused with 5-FU through peripheral vein(caudal vein), hepatic artery, hepaticportal vein or hepaticportal vein with ligated hepatic artery, which dose was 20 mg/kg. High performance liquid chromatography was adopted to measure the content of 5-FU in hepatoma, liver tissue and plasma, and the drug penetration rate among them were calculated.Results:The group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery reached the highest concentrations of 5-FU in live tissue andhepatoma, which concentrations were (22.1±9.5) μg/g and (16.4±7.2) μg/g. Then was the hepatic artery group, and the concentration of the hepaticportal vein group in the hepatoma focus was much smaller than the former 2 groups, which was (8.9±3.7) μg/g. The peripheral vein group got the lowest concentrations both in the liver tissue and hepatoma, which were (9.4±3.7) and (4.3±2.2) μg/g. The concentrations of 5-FU in the plasma in the peripheral vein group, the hepatic artery group, the group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery and the hepaticportal vein group were (26.8±12.5), (16.4±9.7), (15.9±10.1) and (14.9±8.5) μg/mL, which indicated that the drug concentrations of the latter 3 groups were much lower than the former group. The hepatoma/plasma penetration rate of 5-FU in the group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery, the hepatic artery group, the hepaticportal vein group and the peripheral vein group were 103.47%, 92.94%, 59.58% and 16.08%.Conclusion:Compared to the peripheral venous bolus injection, locoregional infusion could significantly increase the concentrations of chemotherapy agent in hepatoma focus and liver tissue, and decrease the drug distributions in peripheral blood. And the infusion through hepaticportal vein with ligated hepatic artery and through hepatic artery reaches higher concentrations in the hepatoma focuses, which indicate that they are 2 practical and promising routes for the locoregional chemotherapy of hepatoma.

Fluorouracil; Hepatoma; Regional chemotherapy; Penetration rate

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.008

R735.7；R73-36

A

1007-3639(2015)01-0045-05

2014-03-16

2014-12-03）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B020800001)、廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2010324)、東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010105150009)。

鄭驚雷 E-mail:jlzheng@126.com