遲廣俊，劉俊輝，鮑峰玉，張文娟，秦炎龍，孫世豪，宗永立，張建勛，邱寶平，劉曉旭，郭 鵬，趙秀杰，柴國璧*，張啟東*

1.紅塔遼寧煙草有限責任公司，沈陽市和平北大街26號 110001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)煙草香料基礎研究重點實驗室，鄭州高新區(qū)楓楊街2號 450001

3.河南農(nóng)業(yè)大學理學院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63號 450002

初烤煙葉提取物中酸味關鍵成分的感官導向分析

遲廣俊1，劉俊輝2，鮑峰玉3，張文娟2，秦炎龍3，孫世豪2，宗永立2，張建勛2，邱寶平1，劉曉旭1，郭 鵬1，趙秀杰1，柴國璧*2，張啟東*2

1.紅塔遼寧煙草有限責任公司，沈陽市和平北大街26號 110001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)煙草香料基礎研究重點實驗室，鄭州高新區(qū)楓楊街2號 450001

3.河南農(nóng)業(yè)大學理學院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63號 450002

為考察煙葉的酸味關鍵成分，利用凝膠滲透色譜（GPC）分離初烤煙葉的提取物，根據(jù)各流份滋味特征評價結果，合并酸味流份，得初烤煙葉提取物的酸味特征組分；建立酸味特征組分中乳酸、乙酰丙酸、蘋果酸、富馬酸、檸檬酸等5種有機酸的離子色譜（IC）定量方法；依據(jù)定量結果，復配上述5種有機酸的混合溶液，分別對酸味特征組分溶液和有機酸復配溶液進行滋味稀釋分析（TDA）；利用三點選配法（3-AFC）測定上述5種有機酸在水中的味覺閾值，結合其在酸味特征組分中的質(zhì)量分數(shù)，計算各有機酸的滋味活性值（TAV）。結果表明：①酸味特征組分溶液和有機酸復配溶液在TDA實驗中表現(xiàn)出一致的最大稀釋倍數(shù)，證明所考察的5種有機酸是酸味特征組分中酸味的主要來源。②根據(jù)5種有機酸的TAV推測其對酸味的貢獻排序為蘋果酸＞乳酸＞乙酰丙酸＞檸檬酸＞富馬酸。

烤煙；感官導向分析；酸味；滋味稀釋分析；滋味活性值；凝膠滲透色譜（GPC）；離子色譜；三點選配法

目前針對煙草制品味覺成分的研究較少，且主要集中于對卷煙主流煙氣的味覺成分分析方面［1-3］，鮮見直接針對煙葉固有味覺關鍵成分的分析。然而，對于在口腔、鼻腔中直接使用的無煙氣煙草制品，煙葉味覺成分對產(chǎn)品的感官品質(zhì)會產(chǎn)生直接影響。針對煙葉原料中的味覺成分開展研究，對無煙氣煙草制品的研發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。煙葉酸味關鍵成分研究涉及有機酸分析，而目前煙葉中有機酸的分析報道中，多將有機酸作用歸結為對卷煙煙氣香氣特征及舒適性特征的影響［4-8］。冒德壽等［9］將滋味活性值（Taste active value，TAV）的概念引入到卷煙煙氣有機酸的分析中，對煙氣中27種有機酸的酸味貢獻進行了研究。在食品科學領域，感官導向分析是在成分復雜的體系中尋找味覺關鍵成分的有效方法，且該分析方法所獲得的關鍵成分與食品味覺特征具有直接的因果聯(lián)系［10-14］。為此，利用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC）分離初烤煙葉的提取物，評價各分離流份的味覺特征，定位并合并酸味特征流份得到酸味特征組分；建立該組分中5種有機酸的離子色譜（Ion chromatography，IC）定量方法，并進行滋味稀釋分析（Taste dilution analysis，TDA）；利用三點選配法（Three-alternative forced-choice，3-AFC）測定各有機酸的味覺閾值，計算了有機酸的TAV值，旨在考察各有機酸對酸味特征組分味覺特征的貢獻。相比于陳化煙葉，以化學成分相對簡單的初烤煙葉作為感官導向分析的研究對象，有利于研究方法的建立和驗證。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2014年河南許昌初烤煙葉B2F。

蘋果酸（98%，F(xiàn)luka公司）；富馬酸（99%）、乳酸（AR）（Acros公司）；乙酰丙酸（98%，Alfa Aesar公司）；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（衍生化級）、檸檬酸（99.5%）（Sigma-Aldrich公司）；無水乙醇、吡啶（色譜純，Merck科技公司）；蒸 餾 水（10 M Ω·cm，Watsons Water公 司）；Sephadex LH-20填料（GE Healthcare公司）。

7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司）；ICS-5000離子色譜儀［配備EGC-KOH淋洗液發(fā)生器、CD50A電導檢測器、ASRS300陰離子自再生膜抑制器（4 mm）］、IonPac AG11-HC陰離子保護柱（4 mm×50 mm）、Ionpac AS11-HC陰離子交換色譜柱（4 mm×250 mm）（Thermo Fisher Scientific公司）；8894型超聲儀（Cole Parmer公司）；R-210型旋轉蒸發(fā)儀、凝膠色譜柱（2.6 cm×100 cm）（Büchi公司）；FreeZone 6 L凍干機（Labconco公司）；WGL-30B電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特公司）；RH800型粉碎機（浙江榮浩公司）；CP2245型電子天平（感量0.000 1 g，Sartorius公司）；超濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉提取物的制備

按 YC/T 31—1996［15］規(guī)定的煙葉樣品干燥方法，將烤煙樣品40℃烘烤2 h后，放入粉碎機中粉碎。取100 g煙粉，在500 mL乙醇水溶液（75%，體積比）中回流提取2 h，過濾后旋轉蒸發(fā)（40℃，體系壓力5 kPa）除去溶劑，得棕黃色煙葉提取物約30 g。

1.2.2 煙葉提取物的分離和酸味特征組分的定性分析

將6 g上述煙葉提取物溶于15 mL蒸餾水中，經(jīng)超濾膜過濾后，用GPC法分離，由10位評委通過直接品嘗的方式，對各流份的滋味特征進行評價，確定具有酸味的特征流份。評價結果須至少8位評委意見一致才被接受。合并酸味特征流份，冷凍干燥后得到約500 mg淡黃色固體，即為酸味特征組分。將5 mg酸味特征組分溶于1 mL吡啶中，加入100μL BSTFA，在60℃水浴中衍生化1 h，進行GC/MS分析，利用NIST08和Wiley譜庫，以匹配度高于85%者定性。GPC分離條件為：

流動相：蒸餾水；填料：Sephadex LH-20；流速：1 mL/min。通過收集器每10 min收集一個流份，共收集40個流份；紫外檢測儀監(jiān)測以確定收集流份的起點和終點。

GC/MS分析條件為：

色譜柱：DB-5MS（60 m×250μm×0.25μm）；載氣：He；柱流量：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：50℃（3 min） 3℃/min250℃；分流模式：不分流；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：33～450 amu。1.2.3 酸味特征組分中5種有機酸的離子色譜定量

酸味特征組分在存儲過程中由于吸收水分導致各有機酸質(zhì)量分數(shù)發(fā)生變化，為保持定量分析結果和感官評價實驗的一致性，將配制的酸味特征組分的水溶液（91.4 mg/mL）密封、避光儲存于4℃冰箱中，作為酸味特征組分儲備溶液供定量分析和感官評價實驗共同使用。儲備溶液保存不超過1周。

移取400 μL酸味特征組分儲備溶液置于10 mL容量瓶中，加水定容，作為進樣溶液。取1 mL進樣溶液，經(jīng)超濾膜過濾后進行乳酸、乙酰丙酸、蘋果酸、富馬酸和檸檬酸等5種有機酸（以下簡稱5種有機酸）的IC定量分析。

IC分析條件為：

色譜柱：Ionpac AS11-HC陰離子交換色譜柱（4 mm×250 mm）；IonPac AG11-HC陰離子保護柱（4 mm×50 mm）；淋洗液：KOH梯度淋洗；流速：1.0 mL/min；抑制器電流：150 mA；柱溫：30 ℃；電導檢測器溫度：35℃；進樣量：25 μL；梯度條件：0～12 min，0.8 mmol/L KOH；12～25 min，0.8～20.0 mmol/L KOH；25～33 min，20.0～12.0 mmol/L KOH；33～40 min，12.0～50.0 mmol/L KOH；40～45 min，50.0 mmol/L KOH；45～50 min，50.0～0.8 mmol/L KOH；50～60 min，0.8 mmol/L KOH。

1.2.4 酸味特征組分溶液和5種有機酸復配溶液的TDA比較

依據(jù)定量分析結果，計算1.2.3節(jié)中所述酸味特征組分儲備溶液中5種有機酸的濃度，配制5種有機酸的混合水溶液，使該溶液中各有機酸具有和酸味特征組分儲備溶液中相同的濃度。將酸味特征組分溶液和有機酸復配溶液分別逐級等倍稀釋6次，獲得兩組各7個濃度等倍降低的溶液系列，記錄各溶液的稀釋倍數(shù)。對兩組溶液系列進行TDA比較研究。TDA方法為：依據(jù)GB/T 12312—2012［16］的要求，對 10 位味覺評價人員進行味覺校正和訓練。10位味覺評價人員通過三點法對上述兩組溶液系列進行味覺辨識：即針對每個溶液，評價人員僅通過味覺特征評價，從溶液和2個空白水樣中，辨識出該溶液；有7位以上評價人員結論一致時，辨識結果方被接受，否則即認為該濃度下待評價溶液無法與空白水樣區(qū)分。對比兩組溶液系列中，可辨識的最小濃度溶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.5 5種有機酸味覺閾值的測定和在酸味特征組分中的TAV比較

依據(jù) GB/T 22366—2008［17］中針對最優(yōu)估計閾值（Best estimate threshold，BET）法測定風味物質(zhì)閾值的描述，10位味覺評價人員通過三點法對5種有機酸的味覺閾值進行測定：將各有機酸分別配制成0.5 mg/g的水溶液，并逐級等倍稀釋9次后，分別獲得各有機酸10個濃度等倍降低的溶液系列；針對每個濃度的有機酸溶液，評價人員僅通過味覺特征評價，從溶液和2個空白水樣中辨識出該溶液；對每一個有機酸，以每位評價人員辨識失誤的最高濃度和其緊鄰的更高一級濃度的幾何平均值作為該評價人員評價該有機酸的BET值；分別計算10位評價人員對每個有機酸BET值的幾何平均值，將其作為該有機酸的味覺閾值。以酸味特征組分中各有機酸質(zhì)量分數(shù)（μg/g）與其味覺閾值（μg/g）的比值，作為該有機酸在酸味特征組分中的TAV，比較5種有機酸的TAV差異。

2 結果與討論

2.1 煙葉提取物的味覺導向GPC分離結果

考察了二氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯、乙醇水溶液等不同提取溶劑的提取效率后，考慮滋味特征評價步驟中對樣品毒性的要求，最終確認使用提取效率較高（35%，質(zhì)量分數(shù)）且毒性較小的乙醇水溶液（75%，體積比）做萃取溶劑。所得煙葉提取物整體呈現(xiàn)強烈的辣感，具有微弱的酸味特征?？谇恢械母泄僮饔弥饕譃槲队X和化學感覺兩類：味覺通過味蕾產(chǎn)生，主要包括酸、甜、苦、咸、鮮等幾種基本味覺；化學感覺不需要味蕾參與，而是通過刺激三叉神經(jīng)、喉咽神經(jīng)產(chǎn)生，包括辛辣、清涼、麻刺等［18-19］。本研究中，以酸味為研究對象，但由于實驗中涉及辣感，為準確起見，部分表述使用“滋味”一詞涵蓋味覺和化學感覺兩種不同的口腔感官作用。

味覺產(chǎn)生的機理比較復雜，目前對其認知尚不充分，但許多研究都表明刺激物分子與味覺細胞表面味覺受體的相互作用是味覺產(chǎn)生的關鍵［18］。只有一定空間體積的分子才能與味覺受體發(fā)生相互作用，而GPC正是基于分子體積的差異性進行分離，有可能完成對相似味覺特征分子的有效分離和富集；同時，GPC可用水作為流動相，保持體系pH穩(wěn)定，避免分離過程中產(chǎn)生化學變化。因此，GPC是味覺導向分析研究的常用分離手段［10-13］。

表1為通過GPC得到的40個流份（F1～F40）的滋味特征評價結果。從表1可知：①最先和最后流出的流份無明顯的滋味特征。這可能是因為最先洗脫的是大分子物質(zhì)，其結構和體積不滿足與受體發(fā)生相互作用的條件；最后流出的成分可能由于其濃度很低而沒有表現(xiàn)出明顯的滋味特征。②從F5至F27，所收集流份表現(xiàn)出的滋味特征依次為甜味、酸味、辣感和苦味。各流份之間沒有不具備滋味特征的空白流份，部分流份表現(xiàn)出兩種滋味特征，表明GPC對不同滋味成分分離并不徹底。然而，不同滋味特征流份依次出現(xiàn)，說明在此條件下仍可以達到分離和富集相似滋味特征（結構近似）成分的目的。這在很大程度上簡化和聚焦了研究對象，為后續(xù)的研究提供了方便。將具有酸味特征的F9～F14流份合并，冷凍干燥后得到的酸味特征組分表現(xiàn)出較強的酸味。

表1 GPC流份滋味特征評價結果

2.2 酸味特征組分中5種有機酸的IC定量分析結果

針對酸味特征組分GC/MS分析共定性出5種有機酸：乳酸、乙酰丙酸、蘋果酸、富馬酸、檸檬酸。酸味特征組分樣品的離子色譜圖如圖1所示，可以看出，除乳酸外，其余4種有機酸基本實現(xiàn)了基線分離。酸味特征組分中雜質(zhì)信號未與乳酸實現(xiàn)完全的基線分離，有可能帶來定量結果偏差。由于本研究中定量分析的目的是為感官評價實驗提供依據(jù)，而感官評價本身誤差遠大于儀器分析，因此該偏差尚在可接受范圍之內(nèi)。

5種有機酸的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限、在酸味特征組分中的質(zhì)量分數(shù)以及相對標準偏差如表2所示，各目標物的相對標準偏差在5%以內(nèi)，說明定量結果的穩(wěn)定性較好。為了在計算TAV時與有機酸的閾值單位保持一致，有機酸的質(zhì)量分數(shù)單位采用μg/g。5種有機酸在3個水平的加標回收率如表3所示，各目標物的回收率在92.53%～110.66%之間，說明本方法的測定結果比較準確，基本滿足感官評價實驗的需求。

圖1 酸味特征組分的離子色譜圖

2.3 酸味特征組分溶液和5種有機酸復配溶液的TDA結果

酸味特征組分溶液和5種有機酸復配溶液的TDA實驗結果如表4所示。酸味特征組分溶液和5種有機酸復配溶液均經(jīng)過6次逐級等倍稀釋（總稀釋倍數(shù)為64）后，不再表現(xiàn)出滋味特征。同時，比較兩個系列起始溶液（稀釋倍數(shù)為0）酸味強度的結果表明，兩個起始溶液都表現(xiàn)出明顯的酸味特征，強度基本相當。

表2 5種有機酸的標準曲線、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、質(zhì)量分數(shù)及RSD①

表3 5種有機酸的3個加標水平的回收率和RSD

表4 酸味特征組分溶液和5種有機酸的復配溶液的TDA結果①

由于本實驗中采取感官導向分析方式，只針對GPC分離后具有可感知的酸味特征流份進行分析，且只選擇了結果比較可靠的5種有機酸進行GC/MS定性，故酸味特征組分中有可能存在5種有機酸外的其他酸味成分。然而，在TDA實驗中，稀釋至相同倍數(shù)（64倍）時，酸味特征組分溶液和5種有機酸的復配溶液的酸味特征同步消失；同時，兩個系列的起始溶液酸味強度基本相當。因此，可以認為所分析的5種有機酸基本可以代表酸味特征組分酸味的主要來源。

2.4 5種有機酸味覺閾值的測定和在酸味特征組分中的TAV結果

在不同的文獻記錄中，同一種有機酸的味覺閾值存在很大的差異，例如在1922—2007年的20余條文獻記錄中，乳酸在水中的味覺閾值范圍在10～1 400 μg/g之間［20］。分析出現(xiàn)如此顯著的閾值測定偏差的原因可知，與閾值測定所涉及的閾值定義（覺察閾或辨別閾）、測定方法、評價團隊以及化合物的純度等均有關系。為了增強數(shù)據(jù)的可比性，本研究中采用相同的測定方法和感官評價團隊，對5種有機酸在水中的味覺覺察閾值進行了統(tǒng)一測定，并分別結合其在酸味特征組分中的質(zhì)量分數(shù)（表4）計算了其TAV，見表5。

表5 5種有機酸的味覺閾值及在酸味特征組分中的TAV

在食品科學領域，常將感官活性分子的濃度和感官閾值之比稱作感官活性值（TAV），并作為判斷其感官貢獻大小的指標［21］。當感官活性分子的濃度和感官閾值采用同一單位時，感官活性值是一個沒有量綱的值；并可粗略認為只有感官活性值＞1的成分才具有感官貢獻［21］。

依據(jù)定量實驗和閾值測定結果計算煙葉提取物酸味特征組分中5種有機酸的TAV，將其作為對酸味特征組分酸味貢獻的判斷指標。由表5可以看出：5種有機酸的TAV均大于1，說明其對酸味特征組分的酸味均有貢獻；其貢獻為蘋果酸＞乳酸＞乙酰丙酸＞檸檬酸＞富馬酸。結合上述TDA分析結果，當稀釋64倍時溶液酸味特征消失，計算可知此時溶液中蘋果酸的濃度約為47 μg/g，接近實驗中所測定的蘋果酸的味覺覺察閾值（34 μg/g）。稀釋過程中，當蘋果酸的濃度接近其味覺閾值時，溶液酸味特征同步消失，表明蘋果酸是決定煙葉提取物酸味特征組分酸味最關鍵的成分。

由于本實驗需要通過TDA證明5種有機酸是酸味特征組分酸味的主要來源，因此定量分析只針對煙葉提取物酸味特征組分進行；而判斷煙葉中5種有機酸的酸味貢獻大小，還應當直接測定煙葉中各有機酸的質(zhì)量分數(shù)，然后計算其TAV。

3 結論

對煙葉提取物進行感官導向分離所獲得的酸味特征組分，代表煙葉提取物中酸味最強烈的部分。①乳酸、乙酰丙酸、蘋果酸、富馬酸、檸檬酸等5種有機酸是酸味特征組分酸味的主要來源；②5種有機酸對酸味特征組分的酸味均有貢獻，其貢獻為蘋果酸＞乳酸＞乙酰丙酸＞檸檬酸＞富馬酸，其中蘋果酸是決定煙葉提取物酸味特征組分酸味最關鍵的成分；③感官導向分析可對化學成分相對簡單的初烤煙葉中的酸味關鍵成分進行有效的分析和驗證。本研究的思路和方法，也可應用于陳化煙葉或其他類型煙葉的酸味關鍵成分分析。

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Sensory-oriented Analysis of Key Sour Taste Components in Cured Tobacco Extract

CHI Guangjun1,LIU Junhui2,BAO Fengyu3,ZHANG Wenjuan2,QIN Yanlong3,SUN Shihao2,ZONG Yongli2,ZHANG Jianxun2,QIU Baoping1,LIU Xiaoxu1,GUO Peng1,ZHAO Xiujie1,CHAI Guobi*2,and ZHANG Qidong*2
1.Hongta Liaoning Tobacco Co.,Ltd.,Shenyang 110001,China
2.Key Laboratory of Tobacco Flavor Basic Research of CNTC,Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
3.College of Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

In order to analyze the key sour taste components in leaf tobacco,the extract of cured tobacco was separated by gel permeation chromatography(GPC).According to the taste characteristic of each fraction,the sour taste characteristic components(STCCs)were obtained by categorization.A quantitative method based on ion chromatography was developed to determine five selected organic acids(lactic acid,levulinic acid,malic acid,fumaric acid and citric acid)in the STCCs.On the basis of quantitative data,themixed solutions of the five organic acids were recombined,and the taste dilution analysis(TDA)of STCC solutions and the recombined solutions was conducted.The taste thresholds of the five organic acids in water were determined by three-alternative forced-choice(3-AFC)method,then their taste activity values(TAVs)were calculated by taking into account their contents in STCCs.The results showed that:1)The maximum dilution multiple of STCC solutions was consistent with that of the recombined solutions in TDA experiment,it proved that the five acids were the main sources of sour taste in STCC solution.2)According to their TAVs,the five acids in the order of their contribution to sour taste were malic acid＞lactic acid＞levulinic acid＞citric acid＞fumaric acid.

Flue-cured tobacco;Sensory-oriented analysis;Sour taste;Taste dilution analysis;Taste activity value(TAV);Gel permeation chromatography(GPC);Ion chromatography;3-AFC method

411.1

A

1002-0861（2015）12-0027-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151205

2015-07-24

2015-09-02

國家煙草專賣局資助項目“基于感官組學的卷煙煙氣關鍵成分分析研究”（110201202008）；中國煙草總公司鄭州煙草研究院院長科技發(fā)展基金項目“基于感官組學的煙葉味覺活性成分分析”（432013CA0320）；河南省煙草公司科技項目“基于感官組學的河南省主產(chǎn)區(qū)煙葉特征成分分析研究”（HYKJ2012M09）。

遲廣?。?971—），博士，教授級高工，主要從事煙草化學、配方設計技術研究。E-mail：2605178278@qq.com；*

張啟東，E-mail：qdzhangcn@163.com；柴國璧，E-mail：chaigb@ztri.com.cn

遲廣俊，劉俊輝，鮑峰玉，等.初烤煙葉提取物中酸味關鍵成分的感官導向分析［J］.煙草科技，2015，48（12）：27-32.CHI Guangjun,LIU Junhui,BAO Fengyu,et al.Sensory-oriented analysis of key sour taste components in cured tobacco extract[J].Tobacco Science&Technology,2015,48(12):27-32.

責任編輯 茹呈杰