許 輝，張鴻偉，張 罡，王鳳美

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

動(dòng)物源食品中β受體阻斷劑殘留量測(cè)定的不確定度評(píng)定

許 輝，張鴻偉，張 罡，王鳳美

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS／MS）法測(cè)定動(dòng)物源食品中β受體阻斷劑殘留量的數(shù)學(xué)模型，依據(jù)影響測(cè)量結(jié)果的不確定度來(lái)源，如標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品稱(chēng)量、回歸方程、方法重復(fù)性等，對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評(píng)定和分析，給出了0．5μg／kg檢測(cè)水平下，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中β受體阻斷劑殘留量的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度以及擴(kuò)展不確定度。通過(guò)比較各分量不確定度，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最小二乘法擬合帶來(lái)的不確定度影響最大。

不確定度；β受體阻斷劑；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS／MS）

不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)［1］。一個(gè)完整的測(cè)量結(jié)果，除了給出被測(cè)量的最佳估計(jì)值之外，還應(yīng)同時(shí)給出測(cè)量結(jié)果的不確定度。建立和實(shí)施各類(lèi)檢測(cè)的不確定度評(píng)定方法，既是提高檢測(cè)質(zhì)量的要求，也是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)國(guó)際互認(rèn)所不可缺少的內(nèi)容［2－9］。

β受體阻斷劑是能選擇性地與β腎上腺素受體結(jié)合，從而拮抗神經(jīng)遞質(zhì)和兒茶酚胺對(duì)β受體激動(dòng)作用的一種藥物類(lèi)型。受體阻斷劑具有負(fù)性變時(shí)、變力作用，可引起心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)阻滯，誘發(fā)心力衰竭或心功能惡化，使白細(xì)胞減少，血尿酸升高［10－16］。目前，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）測(cè)定動(dòng)物源食品中β受體阻斷劑殘留量的不確定度評(píng)定尚未見(jiàn)報(bào)道。

本工作按照J(rèn)J1059－2012規(guī)定，對(duì)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中β受體阻斷劑殘留量的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析。根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型，對(duì)各個(gè)分量的不確定度進(jìn)行評(píng)估，得到本實(shí)驗(yàn)的不確定度，以便為科學(xué)地評(píng)定測(cè)量結(jié)果提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器與試劑

Agilent 1290液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；API 5500三重四極桿質(zhì)譜分析儀：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品；T25basic高速均質(zhì)器、渦旋混勻器、HS260basic水平振蕩器：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品；Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀：美國(guó)Caliper公司產(chǎn)品。

阿替洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、卡拉洛爾－D7、比索洛爾：均為德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；阿替洛爾－D7、吲哚洛爾、吲哚洛爾－D7、美托洛爾－D7、醋丁洛爾－D5、比索洛爾－D5、拉貝洛爾：均為加拿大TRC公司產(chǎn)品；普萘洛爾：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；普萘洛爾－D9：加拿大CDN公司產(chǎn)品；噴布洛爾：EDQM公司產(chǎn)品；噴布洛爾－D9：德國(guó)Witega公司產(chǎn)品；醋丁洛爾：美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；甲酸（色譜級(jí)）：美國(guó)Riedel－de Haen公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、正己烷（色譜級(jí)）：B＆J Brand公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Millipore系統(tǒng)制得的超純水。

1．2 樣品前處理

稱(chēng)取（2．00±0．01）g粉碎均勻的試樣，置于50mL離心管中，分別加入40μL 0．1mg／L混合內(nèi)標(biāo)溶液、40μL酶解液和5mL EDTA提取液，渦旋混勻1min，高速均質(zhì)器均質(zhì)，置于50℃水浴振蕩器中恒溫振蕩60min，調(diào)節(jié)pH值。分別加入2g硅藻土、2g NaCl和25mL乙腈，振蕩10min，以10 000r／min離心10min，移取上清液，過(guò)凈化填料，渦旋混勻1min，振蕩5min，以10 000r／min離心5min，移取5mL上清液于40℃下氮?dú)獯蹈?。?mL甲醇－0．2％甲酸水（1∶9，V∶V）復(fù)溶，過(guò)0．22μm濾膜，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 不確定度評(píng)定

2．1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法，測(cè)量計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中待測(cè)組分的殘留量（μg／kg）；C為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度（μg／L）；Cis為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度（μg／L）；Ci為樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度（μg／L）；A為樣液中待測(cè)目標(biāo)物的峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)物的峰面積；Ais為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai為樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V為樣品定容體積（mL）；m為樣品稱(chēng)樣量（g）。

實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度Cis和樣液中內(nèi)標(biāo)物濃度Ci帶來(lái)的不確定度，以及峰面積A、As、Ais、Ai的不確定度，可以并入到由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的樣液中待測(cè)物與其同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比x0中；frep為測(cè)量重復(fù)性影響因素的修正因子，其值為1，因此式（1）可改為：

2．2 不確定度來(lái)源

從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，樣品測(cè)定的不確定度來(lái)源主要有：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel（C）；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校準(zhǔn)引入的不確定度urel（x0）；樣品稱(chēng)量引入的不確定度urel（m）；樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度urel（V）；結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度urel（frep）。不確定度來(lái)源示意圖示于圖1。

圖1 不確定度來(lái)源示意圖Fig．1 The schematic of uncertainty source

上述各參數(shù)影響相互獨(dú)立，因此其相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）可表征為以上5項(xiàng)不確定度的平方和再開(kāi)二次方。

2．3 各分量不確定度的計(jì)算

2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel（C）

準(zhǔn)確稱(chēng)取各約10mg 9種標(biāo)準(zhǔn)品，分別移入10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成1 000mg／L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；從中分別移取100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為10mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；從混合標(biāo)準(zhǔn)中間液中移取100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為100μg／L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。按如上操作，稱(chēng)取一定量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，分別獲得濃度為1 000mg／L、10mg／L、100μg／L內(nèi)標(biāo)混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制包括β受體阻斷劑類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和β受體阻斷劑類(lèi)內(nèi)標(biāo)溶液的配制，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（C）＝以吲哚洛爾為例，其標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度評(píng)定如下：

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

（1）吲哚洛爾純度為98．0％，其相對(duì)不確

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量使用萬(wàn)分之一天平，精確至0．1mg。天平校準(zhǔn)證書(shū)給出的不確定度為0．17mg，k＝2，則校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u1（w）＝0．17／2＝0．985mg；利用《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》［7］附錄G中給定的數(shù)據(jù)，對(duì)十萬(wàn)分之一分析天平最后一位有效數(shù)字為0．01mg，則由天平重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度為u2（w）＝0．5×0．01＝0．05mg。標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)樣量為10．2mg，因此，標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0．008 35。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品配制所使用的10mL A級(jí)容量瓶20℃時(shí)的容量允差為±0．020mL，服從三角分布，區(qū)間半寬度此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（V10）＝a（V10）／k＝0．008 17mL；實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±5）℃之間變動(dòng)，甲醇的膨脹系數(shù)（20℃）為0．001 18／℃，對(duì)10mL容量瓶由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化ΔV＝10×5×0．001 18＝0．059mL，服從均勻分布，由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（V10）＝a／k＝0．034 1mL，故：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V1）＝u（V10）／V10＝0．003 52。

使用100μL移液槍稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，其容量允差為±1．0μL，服從均勻分布，由此引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u1（V100）＝a1（V100）／k＝0．057 8μL；由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化ΔV＝100×5×0．001 18＝0．590μL，服從均勻分布，，故稀釋過(guò)程中使用移液槍引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為稀釋過(guò)程中，使用10mL容量瓶和移液槍各2次，其中，10mL容量瓶的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（V10）＝0．035 2mL，移液槍移取的體積均為100μL，故標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，吲哚洛爾標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2）內(nèi)標(biāo)溶液配制引入的不確定度

（2）吲哚洛爾－D7稱(chēng)量引入的不確定度計(jì)算過(guò)程與標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度相同，稱(chēng)樣量為10．3mg，故其相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（w）＝

（3）吲哚洛爾－D7溶液配制和稀釋過(guò)程中，相對(duì)不確定度計(jì)算與標(biāo)準(zhǔn)溶液的計(jì)算方法相同，其值分別為urel2（V1）＝0．003 52、urel2（V2）＝0．006 94；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用100μL移液槍添加內(nèi)標(biāo)溶液，移液槍引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（V100）＝0．671μL，樣品前處理過(guò)程中內(nèi)標(biāo)溶液的移取體積為40μL，故內(nèi)標(biāo)溶液添加引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V3）＝0．671／40＝ 0．016 8。

由此，內(nèi)標(biāo)配制、稀釋、添加過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

故吲哚洛爾－D7內(nèi)標(biāo)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

9種β受體阻斷劑類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度列于表1。

2．3．20．2、0．5、0．8μg／L，其內(nèi)標(biāo)濃度均為0．08μg／L。對(duì)β受體阻斷劑類(lèi)藥物與其內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比x0分別為0、0．125、0．25、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0的8個(gè)校準(zhǔn)溶液各平行測(cè)定3次，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值y；對(duì)以上測(cè)定數(shù)據(jù)采用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到校準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y＝bx＋a和擬合系數(shù)r2，相關(guān)結(jié)果列于表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度Table 1 The relative uncertainty of standard solutions

續(xù)表2

為了評(píng)定最小二乘法估計(jì)量的不確定度，首先必須對(duì)直接測(cè)量所得的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度估計(jì)，實(shí)際上是求出測(cè)量數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

式中，［yi，j－（a＋bxj）］為當(dāng)輸入量為xj時(shí)，儀器響應(yīng)值與擬合直線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值之差。

使用間接式測(cè)量?jī)x器測(cè)量時(shí)，利用校準(zhǔn)曲線(xiàn)，在測(cè)得樣品響應(yīng)值y0后，可按線(xiàn)性回歸方程計(jì)算被測(cè)量的預(yù)估值x0，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中，s（y）為校準(zhǔn)溶液峰面積比殘差的標(biāo)

準(zhǔn)偏差；b為擬合直線(xiàn)的斜率；p為樣品平行測(cè)量次數(shù)，本例為6；n為擬合直線(xiàn)的數(shù)據(jù)對(duì)總數(shù)，本例為24；x0為樣品平行測(cè)量P次結(jié)果的平均值；ˉx為繪制擬合直線(xiàn)全部（n個(gè)）輸入值x1的總平均值，urel（x0）＝u（x0）／x0，計(jì)算結(jié)果列于表3。 2．3．3 樣品稱(chēng)量引入的不確定度 使用百分之一天平稱(chēng)量樣品，稱(chēng)樣量為2．00g，精確至0．01g。天平校準(zhǔn)證書(shū)給出的不確定度為0．005 80g，k＝2，故u（m）＝0．005 80／2＝0．002 90g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（m）＝u（m）／m＝0．001 45。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)引入的不確定度Table 3 The uncertainty of standard curve

2．3．4樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用25．0mL可調(diào)加液器添加乙腈提取液。容量允差為±100．0 μL，服從均勻分布mL；由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化為ΔV＝ 0．171 2mL，服從均勻分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V1）＝u（V10）／V10＝0．011 5。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用5．0mL移液槍移取氮吹濃縮的5mL樣品溶液。移液槍的容量允差為±50．0μL，服從均勻分布28．9μL；由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化為ΔV＝ 34．25μL，服從均勻分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V2）＝u（V5000）／V5000＝0．011 5。

樣品定容使用1 000μL移液槍?zhuān)淙萘吭什顬椤?0．0μL，服從均勻分布，u1（V1000）＝a（V1000）／k＝5．78μL；實(shí)驗(yàn)室溫度引起的體積變化可以忽略不計(jì)，故urel（V3）＝u（V1000）／V1000＝0．005 78。

綜上，樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度為：

2．3．5 結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度 在重復(fù)性條件下，對(duì)樣品進(jìn)行了n次獨(dú)立測(cè)試（n＝6）。以吲哚洛爾為例，平行測(cè)定結(jié)果分別為：0．494、0．574、0．581、0．465、0．508、0．477μg／kg，平均值為根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算得單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）＝

以多次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值為最佳估算值，則測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（ˉX）＝s（ˉX）＝由此引起的結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度0．039 1。由結(jié)果重復(fù)性引入的9種β受體阻斷劑類(lèi)藥物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度列于表4。

表4 結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 4 The relative uncertainty of repeatability of results

3 樣品合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度

由2．2節(jié)求得各物質(zhì)的相對(duì)合成不確定度，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）＝X×urel（X）；取包含因子k＝2，置信概率p＝95％，求得擴(kuò)展不確定度為U（X）＝k×u（X），具體結(jié)果列于表5。

表5 9種β受體阻斷劑類(lèi)藥物的不確定度Table 5 The uncertainty of 9 kinds of beta－blockers

4 結(jié)論

本工作采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)食品中9種β受體阻斷劑的殘留量進(jìn)行測(cè)定，比較各分量不確定度大小，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最小二乘法擬合帶來(lái)的不確定度影響最大；標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、進(jìn)樣過(guò)程、儀器響應(yīng)和測(cè)量的重復(fù)性對(duì)不確定度有一定的貢獻(xiàn)，而樣品稱(chēng)量的不確定度可以忽略不計(jì)。

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Uncertainty Evaluation in the Determination of β－Blockers in Food of Animal Origin

XU Hui，ZHANG Hong－wei，ZHANG Gang，WANG Feng－mei
（Shandong Entry－Exit Inspection Quarantine of the People’s Republic of China，Qingdao 266002，China）

β－Blockers in food of animal origin was determined by liquid chromatographytandem mass spectrometry（LC－MS／MS）．According to the mathematic model，the uncertainty sources of test results were analyzed，such as the standard solution preparation，sample weighing，regression equation，method repeatability．Each component uncertainty was calculated through analyzing．With the limits of quantification of 0．5μg／kg for all analytes，the expanded uncertainty was calculated while the combined standard uncertainty ofβ－blockers residue was obtained．Comparing of each component of uncertainty in the process，the results show that the effect of the least squares fitting is the maximun．

uncertainty；β－blockers；liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0185－08

10．7538／zpxb．youxian．2014．0062

2014－03－16；

2014－07－07

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2007IK144）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008GG10009020）；山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研攻關(guān)項(xiàng)目（SK200820）資助

許 輝（1982—），男（漢族），工程師，從事藥物殘留檢驗(yàn)研究。E－mail：xh2k12＠sohu．com

時(shí)間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0062．html