鴨胸肌肉加熱過程中肌動球蛋白解離研究

鄧少穎，王道營，張牧焓，卞 歡，吳海虹，諸永志，耿志明，劉 芳，徐為民,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學，教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

鴨胸肌肉加熱過程中肌動球蛋白解離研究

鄧少穎1,2，王道營2，張牧焓2，卞 歡2，吳海虹2，諸永志2，耿志明2，劉 芳2，徐為民2,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學，教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

為了解鴨胸肌肉加熱過程中肌動球蛋白變化情況，本實驗以鴨胸肉為材料，研究了加熱溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）和加熱時間（0、1、10、20、30、60 min）對肉中肌動球蛋白解離的影響。采用蛋白質免疫印跡技術測定肌動蛋白的含量。結果表明：在45 ℃加熱條件下，肌動球蛋白幾乎未發(fā)生解離（P＞0.05）；而在50、55 ℃或60 ℃加熱條件下，隨著加熱時間的延長，肌動蛋白含量先增加后降低，但均較對照組顯著性增加（P＜0.05）；65 ℃加熱60 min，肌動蛋白含量降至對照組水平；70 ℃加熱條件下，加熱時間為30 min或60 min，檢測不到肌動蛋白的存在。因此，加熱溫度為50～60 ℃，加熱時間為10～30 min時能顯著促進肌動球蛋白解離。

鴨胸肉；肌動蛋白；加熱

對于肉及其制品，人們大多從色、香、味、嫩等幾個方面進行評價，其中嫩度作為評判指標越來越被更多的消費者所關注[1-2]，對肉嫩度變化機理以及影響肉嫩度變化因素的研究逐漸成為人們研究的熱點問題。熱處理是一種常見的食品加工方式。加熱不僅能夠殺滅細菌、改善風味、熟化食物[3]，而且在一定加熱條件下，肉的嫩度可以得到很大的改善。

宰后僵直期間，嫩度降低，在隨后的解僵成熟過程中，嫩度逐漸得到改善。有研究者觀察動物宰后成熟肉肌纖維的超微結構發(fā)現(xiàn)：隨著肉的成熟，肌節(jié)長度較僵直期間增長[4]。目前，普遍認為肌原纖維緊密結構弱化是肉品嫩度改善的主要原因[5-8]。肌原纖維是由可調節(jié)的粗肌絲和細肌絲組成，粗肌絲主要是由肌球蛋白組成，細肌絲主要是由肌動蛋白組成，并結合有原肌球蛋白和肌鈣蛋白[9]。Takahashi等[10]研究指出：成熟過程中肌節(jié)長度的增加是由于肌動蛋白和肌球蛋白結合狀態(tài)以及結合程度的改變，進而弱化了肌原纖維的緊密結構。有研究者在研究雞肉、兔肉、豬肉、牛肉時發(fā)現(xiàn)：將肉在60 ℃或65 ℃水浴中保留較長時間，肉的剪切力存在下降趨勢，即表明低溫長時間加熱有助于肉嫩度的改善[11-14]。Okitani等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在較低溫度且相對較長時間加熱條件下，肌動球蛋白存在明顯的解離現(xiàn)象，即觀察到肌動蛋白含量的增加，且嫩度較好。本實驗擬對加熱條件對肌動球蛋白的解離規(guī)律進行研究，為提高肉的嫩度、改善肉的品質提供新的研究思路及理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉用麻鴨，購自南京孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場，隨機選取60 日齡左右、大小相近的健康肉用麻鴨，按工業(yè)要求宰殺前禁食、禁水。隨后宰殺、放血、去毛，并迅速取出鴨胸肉，按相應的實驗要求做處理。

抗兔骨骼肌肌動蛋白多克隆抗體、羊抗兔IgG、三羥甲基氨基甲烷（Tris，超純級） 美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒 巴傲得生物科技公司；預染寬范圍標準蛋白（分子質量大小范圍14.4～116 ku） 加拿大Fermentas公司。

1.2 儀器與設備

M124A電子分析天平 意大利Bel Engineering Srl Bel公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；伯樂Mini-PROTEAN?Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng)、Semi-Dry轉印儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肉樣處理

將選取的麻鴨按企業(yè)工藝宰殺后，迅速取出胸大肌，置于4 ℃冰箱中成熟12 h后，去除肌膜、結締組織、脂肪后切碎成肉糜狀，待用。

1.3.2 實驗設計

每份準確稱取2 g經(jīng)1.3.1節(jié)處理過的鴨胸肉樣品，置于5號蒸煮袋中。用玻璃棒擠壓肉糜使之成為厚1 mm左右的薄片。實驗共設45、50、55、60、65、70 ℃ 6 個實驗組，每組又設置0（對照組）、1、10、20、30、60 min 6 個不同的加熱時間。將處理好的肉糜薄片置于對應的恒溫水浴鍋中按上述6 組實驗設計分別加熱到所需時間后，置于冰浴中冷卻至4 ℃左右。每組設置3 個重復。

上周（8月13日-8月17日），出口市場預收訂單充裕，價格高位企穩(wěn)，局部漲跌互現(xiàn)。8月20日中國磷酸二銨批發(fā)價格指數(shù)（CPPI）為 2847.73點，環(huán)比下跌2.66點，跌幅為0.09%；同比上漲221.74點，漲幅為8.44%；比基期下跌374.04點，跌幅為11.61%。

1.3.3 肌動蛋白提取方法

依據(jù)Okitani等[16]的方法，將1.3.2節(jié)經(jīng)過加熱處理并冷卻后的肉糜樣品置于20 mL預冷的 Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl，0.01 mol/L Na2CO3，0.04 mol/L NaHCO3，pH 7.2）中，于冰浴中15 000 r/min勻漿3 次（每次30 s，間隔30 s）。將勻漿液置于4 ℃恒溫搖床培養(yǎng)箱中提取24 h后，加入40 mL蒸餾水稀釋，使KCl的終濃度為0.2 mol/L，搖床振蕩60 min后將溶液進行離心分離，離心條件為：4 ℃，15 000×g，20 min。取上清液制備電泳樣品。

1.3.4 肌動蛋白檢測方法

依據(jù)Okitani等[15-16]的方法，通過測定肌動蛋白含量的變化來反映肌動球蛋白的解離程度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），12%分離膠，5%濃縮膠（m（丙烯酰胺）∶m（甲叉雙丙烯酰胺）=36.5∶1），每孔等體積上樣20 μL，200 V恒壓跑約70 min。電泳結束后，將分離膠中所需蛋白條帶切割下來并在轉膜液中浸泡約15 min后，轉印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。轉印后的PVDF膜在TBST溶液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，0.05%吐溫-20，pH 7.4）中漂洗5 次，每次5 min。然后將帶有蛋白的PVDF膜在含有5 g/100 mL脫脂奶粉的TBST溶液中室溫孵育2 h。在TBST溶液漂洗3 次后，再將PVDF膜與一抗（一抗是抗兔骨骼肌肌動蛋白多克隆抗體，TBST溶液1∶1 000稀釋）結合，4 ℃孵育12 h，然后膜用TBST溶液再次漂洗3 次后與二抗（二抗是辣根過氧化酶連接的羊抗兔IgG，TBST溶液1∶5 000稀釋）結合，室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗3 次后，用DAB顯色劑對膜進行顯色處理，并使用凝膠成像儀拍照。Quantity One軟件掃描蛋白免疫印跡條帶，并進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

凝膠成像儀拍照后的圖片（3 個平行），以Quantity One軟件掃描蛋白免疫印跡條帶，所得的數(shù)據(jù)用SPSS18.0進行One-way ANOVA分析和相關分析，不同處理間 的顯著性差異比較用Duncan’s multiple range tests模型，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 45 ℃水浴條件下加熱時間對肌動球蛋白解離程度的影響

圖1 45℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.1 Dissociation of actomyosin in duck meat heated at 45 ℃ for different time durations

2.2 50 ℃水浴加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響

圖2 50℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.2 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 50 ℃ for different time durations

由圖2A可知，在50 ℃水浴中加熱后，隨著加熱時間的延長，鴨胸肉肉糜中的肌動球蛋白發(fā)生了明顯的解離。通過定量分析（圖2B）可知，加熱時間為10、20、30、60 min的肌動蛋白條帶灰度較對照組均顯著性增加（P＜0.05）；加熱30 min時，肌動蛋白條帶灰度達到最大值，除與加熱20 min時無顯著性差異（P＞0.05），與其他處理組相比均有顯著差異。

2.3 55 ℃水浴加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響

圖3 55℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.3 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 55 ℃for different time periods

由圖3A可知，在55 ℃水浴條件下，各個處理樣的肌動蛋白含量均較對照組明顯增多。隨加熱時間的延長，肌動蛋白含量呈略微下降趨勢。通過定量分析可知（圖3B），不同處理組的肌動蛋白條帶灰度較對照組均顯著性增加（P＜0.05）；在加熱1～20 min過程中，肌動蛋白條帶灰度增加，但增幅并不顯著（P＞0.05），而在加熱30 min后，鴨胸肉肉糜中肌動蛋白條帶灰度呈逐漸降低的趨勢，在加熱30～60 min過程中，肌動蛋白條帶灰度沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 60 ℃水浴加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響

圖4 60℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.4 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 60 ℃ for different time periods

由圖4A可知，各個處理組的肌動蛋白含量均較對照組明顯的增加；隨加熱時間的延長，肌動蛋白含量有降低的趨勢。通過定量分析（圖4B）可知，加熱1 min時肌動蛋白條帶灰度達到最大值，與其他處理組均有顯著差異（P＜0.05）；然后隨加熱時間的延長，肌動蛋白含量逐漸降低，加熱時間為60 min的肌動蛋白條帶灰度除與30 min時相比無顯著性差異外（P＞0.05），與其他組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 65 ℃水浴加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響

圖5 65℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.5 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 65 ℃ for different time periods

由圖5A可知，加熱1 min和10 min時的肌動蛋白含量要明顯高于其他處理組，再隨加熱時間的延長，肌動蛋白條含量逐漸降低。通過定量分析（圖5B）可知，加熱時間為1 min時肌動球蛋白解離即達到最大，此時肌動蛋白條帶灰度與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）；隨加熱時間的延長，肌動蛋白條帶灰度呈梯級態(tài)逐漸減少，加熱10 min時的肌動蛋白條帶灰度與20 min時的無顯著差異（P＞0.05）；加熱20 min時的肌動蛋白條帶灰度與30 min無顯著性差異（P＞0.05）；加熱60 min時，肌動蛋白條帶灰度除與對照組無顯著差異外（P＞0.05），與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 70 ℃水浴加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響

圖6 70℃加熱不同時間對肌動球蛋白解離的影響Fig.6 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 70 ℃ for different time periods

由圖6A可知，在70 ℃水浴中，加熱1 min時肌動蛋白含量最高；隨加熱時間的延長，肌動蛋白含量降低；而當加熱時間延長到30 min和60 min時，則檢測不到肌動蛋白。通過定量分析（圖6B），加熱時間為1 min時的肌動蛋白條帶灰度顯著高于其他處理組（P＜0.05）；加熱時間為10 min和20 min處理組的肌動蛋白條帶灰度無顯著性變化（P＞0.05），但與對照組相比則有顯著差異（P＜0.05）；而加熱時間為20 min時的肌動蛋白條帶灰度則與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

嫩度是評價肉品品質的重要指標之一，嫩度受到宰前、宰后多種因素的影響，最終表現(xiàn)為肌原纖維及結締組織的結構和生化特性對嫩度的影響[17]。肌動蛋白和肌球蛋白絲是構成肌絲的主要蛋白。在活體肌肉中這兩種蛋白是形成肌肉收縮的結構基礎，肌動蛋白和肌球蛋白結合形成肌動球蛋白。鴨胸肉經(jīng)過排酸成熟后，隨著三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的不斷消耗，大量的肌球蛋白和肌動蛋白結合成肌動球蛋白，在宰后成熟過程中，肌動球蛋白幾乎沒有發(fā)生解離[14]。加熱是肉品加工常用的方法，在加熱過程中，肉結構會發(fā)生收縮，肌原纖維蛋白受熱變性，使得肌原纖維蛋白間原來的相互作用力發(fā)生變化[18]。有研究表明在終點溫度為70 ℃，與常規(guī)加熱方式相比，梯度加熱有改善嫩度的趨勢，此過程可能與肌動球蛋白的解離有關[19]。鴨胸肉加熱后，某些蛋白受熱后構象首先發(fā)生改變，進而原來蛋白質分子間的各種作用力以及它們的三維空間構象遭到破壞，使得細胞骨架斷裂，Z盤崩解，加速了肌原纖維蛋白的降解[20]，同時直接或間接地促進肌動球蛋白的解離。本實驗發(fā)現(xiàn)，鴨胸肉肉糜在45 ℃加熱后，肌動球蛋白未發(fā)生顯著性的解離，其可能原因是在該溫度下，肌原纖維的完整結構未遭到破壞，某些相關性的酶未被激活；而肉糜經(jīng)過50～65 ℃加熱處理后，肌動球蛋白大量解離，此結論與Okitani等[15]研究牛肉、豬肉、雞肉在65 ℃加熱條件下肌動球蛋白發(fā)生明顯的解離現(xiàn)象結論一致，且嫩度較好。而在70 ℃加熱30 min以上，檢測不到肌動蛋白，可能是因為肌動蛋白在70～80 ℃結構發(fā)生變化[21]，而肌動球蛋白的最大變性溫度約在80～83 ℃[9,22]，故其可能原因是由于肌動球蛋白的熱變性或肌動蛋白在較高加熱溫度下溶解度或結構發(fā)生了變化。此外，加熱也可能影響某些酶的活性。Wang Daoying等[23]研究發(fā)現(xiàn)將鴨胸肉加熱到中心溫度為50、60、70 ℃時鴨胸肉有較好的剪切力，而且檢測到較高的酶活性，同時觀察到肌動球蛋白發(fā)生了解離，此結論與本實驗的研究結果相一致。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在50～65 ℃觀察到肌動球蛋白的解離可能是由鴨肉內部環(huán)境共同作用而產(chǎn)生的效果。

4 結 論

鴨胸肉肉糜在45 ℃加熱條件下，未觀察到肌動球蛋白明顯的解離現(xiàn)象；在50～65 ℃加熱條件下，肌動蛋白條帶灰度隨加熱時間的延長先增加后降低，并且隨加熱溫度的升高，加熱相對較短的時間即可使肌動球蛋白達到最大的解離效果，在65 ℃加熱條件下長時間加熱使得肌動蛋白條帶灰度降至近似對照組水平。在70 ℃加熱條件下，加熱時間延長至30、60 min時，則檢測不到肌動蛋白的存在。因此，促進鴨胸肉中肌動球蛋白解離的最佳工藝條件為加熱溫度為50～60 ℃，加熱時間為10～30 min。在隨后的研究中，可將此條件應用到完整的鴨胸肉中，研究肌動球蛋白的解離與鴨肉嫩度的相關性，為提高肉品嫩度研究提供理論基礎。

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Heat-Induced Dissociation of Actomyosin in Duck Breast Muscle

DENG Shaoying1,2, WANG Daoying2, ZHANG Muhan2, BIAN Huan2, WU Haihong2, ZHU Yongzhi2, GENG Zhiming2, LIU Fang2, XU Weimin2,*
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The present study was performed to illustrate the change of actomyosin in duck breast muscle upon heat treatment. We examined the effects of heating temperature (45, 50, 55, 60, 65 and 70 ℃) and heating time (0, 1, 10, 20, 30 and 60 min) on the dissociation of actomyosin in duck muscle as evaluated by Western blotting on the basis of the change in its content. Results showed no dissociation of actomyosin was observed when muscles were heated at 45 ℃ (P > 0.05). With the extension of heating time, the actin content increased at the early stages and then declined when muscles were heated at 50, 55 or 60 ℃, but it was signifi cantly higher when compared with that in the control group (P < 0.05). After heating at 65 ℃ for 60 min, the actin content decreased to a level identical to that in the control group; however, after heating at 70 ℃ for 30 or 60 min, the presence of actin was not detected. The results suggested that the dissociation of actomyosin was signifi cantly improved when the muscle was heated at a temperature of 50–60 ℃ for 10–30 min.

duck breast; actin; heating

TS251.68

A

1002-6630（2015）01-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201501001

2014-03-06

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101312）

鄧少穎（1992—），女，碩士研究生，研究方向為肉品質量與安全。E-mail：shaoyinglucky@163.com

*通信作者：徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向為肉品加工與質量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com