耐熱木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表達(dá)及應(yīng)用

沈藝紅，薛業(yè)敏,*，侯靜靜，許家興，李相前

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.淮陰師范學(xué)院 江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223000；3.淮陰工學(xué)院 江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003）

耐熱木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表達(dá)及應(yīng)用

沈藝紅1，薛業(yè)敏1,*，侯靜靜1，許家興2，李相前3

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.淮陰師范學(xué)院 江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223000；3.淮陰工學(xué)院 江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003）

目的：提高海棲熱袍菌（Thermotoga maritima MSB8）來源的木聚糖酶XynB和α-葡萄糖醛酸苷酶AguA生產(chǎn)效率并降低生產(chǎn)成本。方法：利用基因重組技術(shù)將海棲熱袍菌的XynB和AguA基因置于不同表達(dá)盒下構(gòu)建共表達(dá)載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得雙酶混合物進(jìn)而水解樺木木聚糖及玉米芯。結(jié)果：重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA比E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA產(chǎn)酶更具優(yōu)勢(shì)，在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，XynB和AguA的產(chǎn)量分別達(dá)到7.6 U/mL和0.5 U/mL，在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，XynB可達(dá)到10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL。在80 ℃水解條件下，雙酶比單一木聚糖酶能夠更徹底降解樺木木聚糖，所得酶解液中木二糖的含量和純度更高；從還原糖釋放量及電子顯微鏡觀察可以看出雙酶液對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品玉米芯具有良好的降解作用。結(jié)論：XynB和AguA基因（T. maritima）的克隆共表達(dá)具有可行性，并且在生物轉(zhuǎn)化、食品工業(yè)和飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景。

木聚糖酶；葡萄糖醛酸苷酶；共表達(dá)；水解

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，每年可產(chǎn)各種農(nóng)作物秸桿約5.7億 t，玉米芯0.4億 t[1]。這些農(nóng)業(yè)廢棄物絕大部分被燃燒掉，既浪費(fèi)資源又造成環(huán)境污染。若將其降解為低聚木糖，可作為功能因子，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力、抗消化性、無齲齒性及促進(jìn)人體對(duì)鈣的吸收等生理活性[2-4]。因此開發(fā)利用這一類半纖維素可再生資源，既可以相對(duì)減緩資源匱乏，又能達(dá)到清潔環(huán)境的效果，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

到目前為止，已有大量微生物及其所產(chǎn)木聚糖酶用于制備低聚木糖[5-6]。但已有研究表明，玉米芯、甘蔗渣和秸稈等農(nóng)林廢棄 物中約94%的半纖維素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[12]，其結(jié)構(gòu)是以β-1,4糖苷鍵連接的多聚木糖鏈[7]，在D-木糖的第二位氧上連接有D-葡萄糖醛酸并在第3位氧上連接有L-阿拉伯呋喃糖。當(dāng)木聚糖酶作用木聚糖底物時(shí)，這些側(cè)鏈的存在妨礙了木聚糖 酶對(duì)木聚糖底物糖苷鍵的水解[8-9]。α-葡萄糖醛酸苷酶水解葡萄糖醛酸與木聚糖主干上木糖殘基間的α-1,2糖苷鍵，能協(xié)同木聚糖酶的水解作用，加速低聚糖的產(chǎn)生[10-11]。研究表明：α-葡萄糖醛酸苷酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶的聯(lián)合作，不僅加速木聚糖產(chǎn)生木寡糖的反應(yīng)速度，而且使酶解產(chǎn)物中帶有葡萄糖醛酸或阿拉伯糖側(cè)枝的大片段得到有效水解，從而提高低聚木糖的產(chǎn)量和純度[12-14]。Fan Zhanmin等[15]通過連接肽將木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶以及木糖苷酶3 種基因進(jìn)行共表達(dá)，結(jié)果表明該融合蛋白仍保留有原先各自酶的特性，且對(duì)于木聚糖的水解具有協(xié)同作用。因此，構(gòu)建既產(chǎn)α-葡萄糖醛酸苷酶又產(chǎn)木聚糖酶活性的基因工程菌成為獲得更高效降解秸稈木聚糖和價(jià)格低廉的生物催化劑的途徑。

海棲熱袍菌（Thermotoga maritima MSB8）生長(zhǎng)在55～90 ℃的海底火山口附近[16-17]，是一種嚴(yán)格厭氧，桿狀、無孢子的發(fā)酵型真細(xì)菌，該菌所產(chǎn)木聚糖酶B（XynB）和α-葡萄糖醛酸苷酶（AguA）的熱穩(wěn)定性好，在生物處理過程中具有減少污染危險(xiǎn)、加快反應(yīng)速度、提高酶作用底物溶解度和較高的抗化學(xué)變性等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)現(xiàn)有酶法水解木聚糖存在的底物作用濃度低、易污染帶來的效率低和成本高的不足。利用基因重組技術(shù)將T. maritima的XynB和AguA基因置于不同表達(dá)盒下，構(gòu)建雙啟動(dòng)子共表達(dá)載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28axynB-aguA，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）構(gòu)建出既產(chǎn)α-葡萄糖醛酸苷酶又產(chǎn)木聚糖酶的基因工程菌E.coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA，并用誘導(dǎo)表達(dá)所獲得木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的雙酶混合物來水解樺木木聚糖及玉米芯，進(jìn)一步檢測(cè)還原糖釋放量并通過TLC分析酶解產(chǎn)物中各組分的變化，比較分析單一木聚糖酶和雙酶的水解效率，并對(duì)水解前后玉米芯進(jìn)行掃描電鏡分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-28a購自美國Novagen公司，含有海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）木聚糖酶B（XynB）或葡萄糖醛酸苷酶（AguA）的質(zhì)粒pHsh-aguA（構(gòu)建方法見文獻(xiàn)[13]）、pET-20b-xynB （構(gòu)建方法見文獻(xiàn)[18]）。大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）與Escherichia coli TOP10（Promega）分別作為目的基因的表達(dá)宿主和克隆宿主。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶和Pyrobest DNA聚合酶 華美生物工程公司和寶生物工程公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Promega公司；QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 美國Qiagen公司；低聚木糖標(biāo)樣95%純度（木二糖） 山東龍力生物科技股份有限公司。

GF254硅膠板 山東江友硅膠開發(fā)有限公司；PCRMastercycler Personal PCR儀 德國Eppendorf公司；核酸凝膠電泳儀、蛋白電泳儀和凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎儀 上海新芝生物技術(shù)研究所。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)在LB或TB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化用SOC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化子的選擇用含有氨芐青霉素（100 μg/mL）或卡那霉素（30 μg/mL）的培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pHsh-aguA為模板，利用相應(yīng)的上下游引物1和2（引物1：5′-AAAAGGCCTTGACCCCCTTG AATGTGGGGGGAAACA-3′內(nèi)有StuⅠ酶切位點(diǎn)；引物2：5′-CGGCTCGAGCGGATATATATATCTTT CTTCCC-3′內(nèi)有XhoⅠ酶切位點(diǎn)）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增基因片段-Hshrbs-aguA-（Hsh啟動(dòng)子調(diào)控的AguA基因）。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩下產(chǎn)物割膠回收純化。用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和XhoⅠ分別對(duì)純化后PCR產(chǎn)物和pET-20b-xynB載體進(jìn)行雙酶切，膠回收pET-20b-xynB線性載體和目標(biāo)基因，用T4 DNA 連接酶在16 ℃條件下連接載體和目標(biāo)基因過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp抗性平板，通過對(duì)轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證和測(cè)序，確認(rèn)獲得陽性質(zhì)粒pET-20b-xynB-aguA。基因測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，共表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xynB-aguA構(gòu)建方案見圖1。

圖1 共表達(dá)載體pET-20b-xynB aguA的構(gòu)建Fig.1 Construction of coexpression vector pET-20b-xynB-aguA

以質(zhì)粒pET-20b-xynB-aguA為模板，利用上下游引物3、4（引物3：5′- TGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTAAGA-3′內(nèi)有XbaⅠ酶切位點(diǎn)；引物4：5′-CGGCTC GAGCGGATATATATATCTTTCTTCCC-3′內(nèi)有XhoⅠ酶切位點(diǎn)）PCR擴(kuò)增片段-xynB-aguA-（分別由T7和Hsh啟動(dòng)子調(diào)控的共表達(dá)基因XynB-AguA）。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s、56℃ 40 s、72 ℃ 3 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物驗(yàn)證正確后過柱純化，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pET-28a載體雙酶切。割膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證步驟同上，陽性質(zhì)粒命名為pET-28a-xynB-aguA，重組質(zhì)粒構(gòu)建方案見圖2。

圖2 共表達(dá)載體pET-28a-xynB aguA的構(gòu)建Fig.2 Construction of coexpression vector pET-28a-xynB-aguA

1.4.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將質(zhì)粒pET-28a-xynB-aguA和pET-20b-xynB-aguA分別轉(zhuǎn)入E. coli JM109（DE3），分別挑取單菌落接入含有卡那霉素（kana 30 μg/mL）和氨芐青霉素鈉（Amp 100 μg/mL）的4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；種子液轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基（相應(yīng)抗性）中，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.6～0.8后加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，于42 ℃誘導(dǎo)8 h。取菌液1 mL 以5 000×g離心10 min離心收集菌體，400 μL 50 mmol/L 鄰苯咪唑緩沖液 （pH 6.2）重懸，超聲破碎，離心取上清（ 即粗酶液）檢測(cè)胞內(nèi)木聚糖酶活性性和葡萄糖醛酸苷酶活性性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（濃縮膠5%，分離膠10%）檢測(cè)XynB和AguA基因在原核表達(dá)載體中的表達(dá)情況。

1.4.3 重組菌E.coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA產(chǎn)酶

以誘導(dǎo)溫度42 ℃、IPTG 終濃度0.8 mmol/L為初始誘導(dǎo)條件，根據(jù)重組菌在TB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線變化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，誘導(dǎo)8 h，檢測(cè)胞內(nèi)酶活性，SDS-PAGE驗(yàn)證。

1.4.4 酶活性測(cè)定

XynB和AguA酶活性檢測(cè)方法分別參考文獻(xiàn)[19-20]。1.4.5 酶解應(yīng)用

1.4.5.1 樺木木聚糖的酶解

稱取樺木木聚糖80 mg溶于pH 6.6 100 mmol/L的鄰苯咪唑緩沖液中，總體系為2 mL。以單一XynB酶解體系為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)8 h的雙酶液，然后在80 ℃條件下反應(yīng)1、2、4、6、8 h后，5 000×g離心10 min得上清，用DNS法測(cè)還原糖，酶添加量則以等木聚糖酶活力單位（10 U/g底物）為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得到，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。同時(shí)取4 μL上清用于薄層層析技術(shù)（thin-layer chromatography，TLC）分析，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.4.5.2 玉米芯的降解

稱取粉碎后過40 目篩的玉米芯粉末0.1 g溶于pH 6.6 100 mmol/L的鄰苯咪唑緩沖液中，反應(yīng)總體系為2 mL。加入誘導(dǎo)8 h條件下的雙酶液，然后在80 ℃條件下反應(yīng)12 h后取樣用DNS法測(cè)還原糖，并將反應(yīng)后玉米芯殘?jiān)^濾，烘干備用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。將酶解反應(yīng)前后的玉米芯進(jìn)行電子掃描顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)變化，水解率按下式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將T. maritima的XynB和AguA基因置于不同表達(dá)盒下共表達(dá)，使XynB和AguA基因分別帶有獨(dú)立的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子，其中XynB基因置于T7啟動(dòng)子下，AguA基因則置于熱啟動(dòng)子Hsh[21]下（圖3），兩個(gè)基因表達(dá)相對(duì)獨(dú)立，避免多順反子表達(dá)系統(tǒng)存在的多基因表達(dá)不平衡性[22]，以達(dá)到調(diào)控XynB和AguA的表達(dá)比例。

圖3 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.3 Construction of coexpression plasmids

以質(zhì)粒pHsh-aguA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得基因片段Hsh-aguA，大小約為2 000 bp（圖4a泳道2），純化后的PCR產(chǎn)物與pET-20b-xynB連接，經(jīng)StuⅠ和XhoⅠ雙酶切得到大小近2 000 bp和4 700 bp的片段（圖4b泳道2），分別為PCR片段和載體片段。測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒pET-20b-xynB-aguA構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pET-20b-xynB-aguA的構(gòu)建Fig.4 Construction of expression vector pET-20b-xynB-aguA

以pET-20b-xynB-aguA的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得基因片段-xynB-aguA，大小約為3 000 bp（圖5泳道2），純化后的PCR產(chǎn)物與載體pET-28a連接，經(jīng)XbaⅠ單酶切后得到約8 000 bp大小的片段（圖5泳道4），比XbaⅠ單酶切后的pET-28a載體片段（圖5泳道3）大3 000 bp左右，即目的基因片段大小。測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒pET-28a-xynB-aguA構(gòu)建成功。

圖5 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of DNA

2.2 XynB和AguA的共表達(dá)

為了評(píng)估XynB和AguA基因在兩個(gè)不同載體pET-28a和pET-20b中的共表達(dá)效果，將構(gòu)建成功的共表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-xynB-aguA和pET-20b-xynB-aguA轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分析檢測(cè)重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA在不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)和雙酶產(chǎn)量（圖6）。結(jié)果正如圖6A所示，E.coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/ pET-20b-xynB-aguA生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，3 h之前菌體處于生長(zhǎng)延滯期，3～4 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，當(dāng)誘導(dǎo)至6～12 h時(shí)菌體生長(zhǎng)處于平緩期，且由圖可見E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA的菌體生長(zhǎng)和最高OD600nm值（3.6），明顯高于E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA最高OD600nm值（2.5）；進(jìn)一步檢測(cè)XynB和AguA的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA更具優(yōu)勢(shì)，其結(jié)果見圖6B，重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA中XynB和AguA隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后雙酶產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為7.6 U/mL（XynB）、0.5 U/mL（AguA）以及1.7 U/mL（XynB）、0.06 U/mL（AguA），XynB和AguA基因在載體pET-28a比在pET-20b中表達(dá)的產(chǎn)酶水平分別提高3.5 倍和7.3 倍；這可能與pET-28載體存在一個(gè)額外表達(dá)阻遏蛋白lacI基因有關(guān)，相反，pET-20b載體不含有阻遏蛋白lacI基因，這樣當(dāng)外源基因高效表達(dá)時(shí)宿主本身表達(dá)的阻遏蛋白量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足于控制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄翻譯而同時(shí)又無額外阻遏蛋白的補(bǔ)充，繼而產(chǎn)生外源蛋白的滲漏表達(dá)造成對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制而影響重組菌的產(chǎn)酶水平，這也被圖6A重組菌的生長(zhǎng)曲線結(jié)果所印證。取等體積粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠），并以空載pET-20b為對(duì)照，考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果見圖6C，XynB（43 kD）和AguA（72 kD）基因在載體pET-28a中的表達(dá)量（圖6C：泳道6、7、8）明顯高于其在pET-20b中的表達(dá)量（圖6C：泳道3、4、5），與圖6B的產(chǎn)酶水平結(jié)果一致。

圖6 兩種重組菌中XynB和AguA的表達(dá)Fig.6 Expression levels of XynB and AguA in two recombinant E. coli strains

有研究表明TB培養(yǎng)基更有利于重組菌目的蛋白的表達(dá)[23]，本實(shí)驗(yàn)將重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA置于TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況，結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，OD600nm在0.5～2.0、2.0～3.5和3.5～5.0時(shí)分別為菌體生長(zhǎng)的延滯期、對(duì)數(shù)期和中后期，菌體生長(zhǎng)至6 h時(shí)OD600nm可達(dá)4.5。

圖7 重組菌在TB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curves of recombinant E. coli in TB medium

重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA在不同時(shí)機(jī)即OD600nm為分別1.0、2.0和3.5時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)8 h后，測(cè)得在對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)產(chǎn)酶量最高，其中XynB為10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL（表1），表明誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)基因表達(dá)效果影響很大[24]，加入過早或過遲，雙酶的表達(dá)水平都不夠理想。延滯期菌體生長(zhǎng)密度低，因IPTG有一定毒性，過早加入誘導(dǎo)劑會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，而菌體生長(zhǎng)中后期時(shí)，大多菌體已趨于成熟，生長(zhǎng)活力較低，且培養(yǎng)過程中積累了一定的代謝副產(chǎn)物不利于外源蛋白的合成。收集菌體并破細(xì)胞，離心得上清取等體積進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色表明，在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期時(shí)添加誘導(dǎo)劑所產(chǎn)生的XynB和AguA條帶最粗（圖8，泳道3），這與其產(chǎn)酶水平的分析結(jié)果（表1）一致。

表1 重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)產(chǎn)酶量（酶活性）Table 1 Expression levels of recombinantE. coli JM109 (DE3)/ pET-28a-xynB-aguA with different induction time points

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)XynB和AguA的表達(dá)Fig.8 Expression levels of XynB and AguA with different induction time points

后續(xù)研究將進(jìn)一步提高重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA的產(chǎn)酶水平，優(yōu)化XynB和AguA活力比例使其達(dá)到最佳酶解效率。

2.3 樺木木聚糖的酶解

樺木木聚糖是典型的4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，為了評(píng)估木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶共同降解純化木聚糖的效果，本實(shí)驗(yàn)選擇樺木木聚糖為底物，以4 g/100 mL的底物，加入重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28axynB-aguA所產(chǎn)的雙酶液（其中XynB為10 U/g和AguA為1 U/g），在80 ℃條件下水解不同時(shí)間，以單一木聚糖酶（重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB所產(chǎn)的XynB，10 U/g）水解為對(duì)照，通過DNS測(cè)定還原糖釋放量以及TLC分析酶解產(chǎn)物組分（圖9），比較雙酶與單酶水解木聚糖底物的效率。

圖9 單一木聚糖酶和雙酶對(duì)樺木木聚糖水解的還原糖釋放量（A）和TLC圖譜（BB）Fig.9 Sugar release (A) and TLC spectrum(B) on single and dual enzymatic hydrolysis of birch xylan

由圖9A可知，雙酶與單一木聚糖酶水解釋放還原糖量均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且雙酶水解時(shí)，還原糖釋放變化率較單酶快，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖釋放質(zhì)量濃度持續(xù)增加，水解8 h后還原糖釋放質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL，高于單酶水解還原糖釋放質(zhì)量濃度的14 mg/mL，表明雙酶具有更高的水解效率。由圖9B可知，當(dāng)水解1 h時(shí)，雙酶水解產(chǎn)物中木二糖及以上聚合度寡糖完全降解（圖9B中泳道7），而單酶水解產(chǎn)物中直至8 h仍有更高聚合度木寡糖殘留（圖9B中泳道6），這表明雙酶具有更高的催化效率，其含有的葡萄糖醛酸苷酶比例足以保證樺木木聚糖的徹底降解；同時(shí)，與單酶水解產(chǎn)物相比，雙酶水解液中木二糖含量和和純度更高（圖9B中泳道7～10，產(chǎn)物主要為木二糖），這些結(jié)果表明，木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶間存在著協(xié)同水解作用，當(dāng)葡萄糖醛酸苷酶水解去除掉葡萄糖醛酸側(cè)枝后減少了木聚糖酶作用底物的空間位阻，而提高水解木聚糖底物的效率。與Sunna等[10]的研究結(jié)果一致。且已有研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖對(duì)于雙歧桿菌增殖具有促進(jìn)作用[25-26]，被稱為“超強(qiáng)雙歧因子”，它可以抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長(zhǎng)，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能，增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防疾病發(fā)生的效果[27]。本實(shí)驗(yàn)雙酶制得的低聚木糖不僅木二糖含量更高且純度更好，具有潛在的應(yīng)用前景。

2.4 玉米芯的降解

玉米芯是重要的農(nóng)業(yè)廢棄物，廣泛用于飼料加工業(yè)[28-29]，為提高其可消化率，本實(shí)驗(yàn)選擇玉米芯為底物，嘗試木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶共同降解玉米芯的效果，并用DNS法測(cè)定還原糖釋放率，結(jié)果顯示玉米芯經(jīng)雙酶液水解后水解率可達(dá)到24%。用掃描電鏡觀察玉米芯酶處理前后表面形態(tài)的變化的結(jié)果見圖10。從300 倍電鏡掃描（圖10A、10C）可以看出，未處理玉米芯表面結(jié)構(gòu)致密，呈現(xiàn)有序、有規(guī)律的排列，纖維表面比較完整，無損傷，存在著細(xì)小的褶皺硅質(zhì)；酶處理后的玉米芯表面出現(xiàn)許多致密的孔洞，且表面“溝壑狀”結(jié)構(gòu)清晰可見。從1 000 倍電鏡掃描（圖10B、10D）可以看出，未處理玉米芯表面被許多被突起、硅細(xì)胞、栓細(xì)胞所覆蓋，整體排列緊密；而酶處理后玉米芯表面明顯有破洞，表明其半纖維結(jié)構(gòu)被酶水解破壞，且酶法處理比Kahar等[30]報(bào)道的硫酸處理法更溫和且環(huán)保，因此表明該雙酶液降解效果顯著。玉米芯含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維，還含有豐富的礦物質(zhì)、維生素和微量元素[31]，不僅可作為制取益生因子低聚木糖的理想來源，還可以將玉米芯粉經(jīng)過酶預(yù)處理后促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料用糧中的非淀粉多糖，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，增強(qiáng)牲畜適口性，因此具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

圖10 玉米芯酶解前后電子顯微鏡圖Fig.10 Electron microscope pictures of corncob before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié) 論

海棲熱袍菌是極耐熱性酶的重要來源，但該菌生長(zhǎng)條件要求苛刻，細(xì)胞密度較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，構(gòu)建合適的極端菌的外源基因表達(dá)系統(tǒng)來高效表達(dá)耐熱耐堿酶蛋白，一直是人們研究的熱點(diǎn)，且分別生產(chǎn)多個(gè)木聚糖降解酶既耗費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)資金。本研究選用大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）為表達(dá)宿主，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建共表達(dá)載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA在大腸桿菌中同時(shí)生產(chǎn)XynB和AguA從而獲得雙酶混合物，結(jié)果表明重組菌E.coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，XynB和AguA的產(chǎn)量分別達(dá)到7.6 U/mL和0.5 U/mL，比重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA產(chǎn)酶提高近一倍，進(jìn)一步在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，XynB可達(dá)到10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL；在低聚木糖的制備中，雙酶在相同的條件下相比單酶能夠徹底快速地水解樺木木聚糖產(chǎn)生木寡糖，酶解產(chǎn)物中木二糖含量及純度更高，且對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品玉米芯具有良好的降解效果。有報(bào)道[32]表明，動(dòng)物食用含低聚木糖的飼料后，能提高動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)免疫力。為能夠?qū)⒃撌葻崮揪厶敲赶祽?yīng)用于食品釀造或其他加工行業(yè)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的探索，如選擇食品安全級(jí)的表達(dá)宿主：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等。

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Coexpression and Application of Thermostable Xylanase and Glucuronidase

SHEN Yihong1, XUE Yemin1,*, HOU Jingjing1, XU Jiaxing2, LI Xiangqian3
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology, Huaiyin Normal University, Huaian 223000, China; 3. Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China)

Objective: To improve the productivity and reduce production costs of xylanase (XynB) and α-glucuronidase (AguA) from Thermotoga maritima MSB8. Methods: Gene recombination technology was used to clone the XynB and AguA genes into different BioBrick base vectors, thus constructing pET-20b-xynB-aguA and pET-28a-xynB-aguA. These plasmids were then transformed into Escherichia coli JM109 (DE3), respectively, to induce the coexpression of the two enzymes for hydrolysis of birch xylan and corncob. Results: After 8 hours of induction, the recombinant E. coli JM109 (DE3)/pET-28a-xynB-aguA produced XynB and AguA with the yields reaching 7.6 and 0.5 U/mL in LB medium, respectively, which were higher than those of E. coli JM109 (DE3)/pET-20b-xynB-aguA. In TB medium, XynB activity reached 10.27 U/mL and AguA activity reached 1.5 U/mL. At 80 ℃, combination of both enzymes degraded birch xylan more thoroughly than single xylanase, resulting in a higher content and purity of xylobiose in hydrolyzate. The amount of reducing sugar released and electron microscopy observation revealed good degradation of corncob. Conclusions: Cloning and co-expression of XynB and AguA from T. maritima are practicable and the recombinmant XynB and AguA have potential applications in biotransformation, food industry, feed production and other areas.

xylanase; glucuronidase; coexpression; hydrolysis

Q814.9

A

1002-6630（2015）01-0146-07

10.7506/spkx1002-6630-201501028

2014-01-14

江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（JSBEET1301）；

江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實(shí)驗(yàn)室開放課題（JPELBCPL2012002）

沈藝紅（1989—），女，碩士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品功能因子。E-mail：shenyihong1989@foxmail.com

*通信作者：薛業(yè)敏（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與可再生資源。E-mail：xueyemin@njnu.edu.cn