羅 媛， 侯靖宇， 謝玉敏， 朱 迪， 王愛民， 李勇軍， 黃 勇*

（1.貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

紫金透骨噴霧劑的皮膚刺激性、過敏性、急性毒性研究

羅 媛1，2， 侯靖宇2， 謝玉敏2， 朱 迪2， 王愛民3， 李勇軍3， 黃 勇2*

（1.貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

目的 評(píng)價(jià)紫金透骨噴霧劑皮膚用藥的安全性。方法 采用豚鼠進(jìn)行皮膚刺激性試驗(yàn)，觀察用藥后全身狀況及局部皮膚的變化；采用豚鼠進(jìn)行主動(dòng)過敏性試驗(yàn)，觀察紫金透骨噴霧劑是否引起豚鼠皮膚或全身過敏性反應(yīng)；采用日本大耳白兔進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察完整皮膚及破損皮膚多次接受受試藥物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)。結(jié)果 紫金透骨噴霧劑對(duì)豚鼠和日本大耳白兔完整皮膚無刺激作用，對(duì)破損皮膚有輕度可逆的刺激性反應(yīng)；對(duì)豚鼠無皮膚過敏反應(yīng)；對(duì)日本大耳白兔皮膚未見急性毒性反應(yīng)。結(jié)論 紫金透骨噴霧劑皮膚局部用藥安全性良好。

紫金透骨噴霧劑；刺激性；過敏性；急性毒性；安全性

紫金透骨噴霧劑處方源于貴州黔西南州中醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，由紫金蓮、透骨香、白及、松節(jié)油和冰片5味我省地產(chǎn)草藥組成，具有活血散瘀、消腫止痛、舒筋通絡(luò)之功效，臨床以酒劑外用于治療跌打損傷、扭傷、關(guān)節(jié)腫痛等癥，具有堅(jiān)實(shí)的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。課題組在充分發(fā)揮我省天然藥物資源優(yōu)勢和繼承傳統(tǒng)中藥特色基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代制劑提取技術(shù)富集有效成分，將其研制成了現(xiàn)代中藥噴霧劑，具有方便攜帶、速效、給藥劑量準(zhǔn)確、藥物的穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。藥理作用研究表明，紫金透骨噴霧劑能明顯減輕軟組織損傷的水腫程度，減少瘀血面積，具有明顯的消炎、鎮(zhèn)痛作用，能一定程度上改善血液流變學(xué)，促進(jìn)局部微循環(huán)，可用于治療急性閉合性軟組織損傷［1-2］。為進(jìn)一步考察其安全性，參照 《中藥、天然藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》 （2005年版）和相關(guān)文獻(xiàn)［3-15］，進(jìn)行了紫金透骨噴霧劑皮膚刺激性、過敏性和急性毒性研究，并對(duì)該藥進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，為臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 供試藥 紫金透骨噴霧劑 （貴陽醫(yī)學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，規(guī)格30 mL/瓶，批號(hào)20130318）；2，4-二硝基氯代苯 （上海化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)020711）。

1.2 動(dòng)物 豚鼠，體質(zhì)量300～350 g，雌雄兼用，雌性無孕。日本大耳白兔，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，雌雄兼用，雌性無孕。均由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（黔）2002-0001。

1.3 組別及劑量設(shè)置

1.3.1 皮膚刺激性試驗(yàn) 設(shè)置高、中、低3個(gè)劑量給藥組及對(duì)照組。給藥組用藥劑量分別為0.6 g生藥/（kg·d）、0.3 g生藥/（kg·d）、0.15 g生藥/（kg·d）3個(gè)劑量。

劑量設(shè)置：紫金透骨噴霧劑擬推薦的臨床成人用法用量為，皮膚局部給藥，每日5 mL，成人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，折合0.025 g生藥/（kg·d）。所設(shè)劑量相當(dāng)于成人日用藥劑量的24、12、6倍。

配制方法：本品0.3 g生藥/mL，組間劑量比設(shè)置為1∶2。為保證足夠的給藥劑量，高劑量組采取以原藥液2 mL/（kg·次）-1的方式進(jìn)行。則3個(gè)劑量組的配制方法為：高劑量組，原藥液直接使用 （臨床給藥劑量），給藥劑量為0.3 g生藥/mL×2 mL/kg=0.6 g生藥/kg；中劑量組，取原藥液，以75%乙醇 （紫金透骨噴霧劑溶媒）稀釋為1/2使用，給藥劑量為0.3 g生藥/kg；低劑量組，取原藥液，以75%乙醇稀釋為1/4使用，給藥劑量為0.15 g生藥/kg；溶媒對(duì)照組為75%乙醇。

1.3.2 皮膚過敏性試驗(yàn) 設(shè)置溶媒對(duì)照組 （75%乙醇）、受試物組 （紫金透骨噴霧劑原藥液）、陽性對(duì)照組 （1%2，4-二硝基氯代苯溶液）。

1.3.3 急性毒性試驗(yàn) 設(shè)置給藥組 （紫金透骨噴霧劑原藥液）及對(duì)照組 （蒸餾水），給藥組用藥劑量為3 g生藥/（kg·d）。

2 方法

2.1 皮膚刺激性試驗(yàn)［3-8］取豚鼠48只，雌雄各半，于給藥前小心剪盡動(dòng)物背部左右兩側(cè)被毛，去毛區(qū)為4 cm×

4 cm，去毛后24 h，檢查去毛皮膚是否因去毛而劃破，如皮膚受傷，該豚鼠不宜用作完好皮膚的刺激性實(shí)驗(yàn)。將豚鼠分為完整皮膚和破損皮膚受試組，破損皮膚組用滅菌針尖將去毛消毒皮膚劃破，以輕微滲血為度，布滿整個(gè)去毛區(qū)。將完整皮膚和破損皮膚組分別分為3個(gè)劑量組給藥，每組8只。按各組劑量給藥，對(duì)照組與給藥組采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，均右側(cè)涂以藥物，左側(cè)涂等量75%乙醇，用藥后用紗布和膠帶覆蓋固定。各組動(dòng)物均于24 h后去除覆蓋物，用清水洗去殘留受試物。單次給藥組動(dòng)物僅給予1次；多次給藥組動(dòng)物每天給藥1次，連續(xù)7 d。單次給藥組動(dòng)物于去除受試物1、24、48和72 h；多次給藥組動(dòng)物于每天給藥后24 h、末次給藥后1、24、48和72 h，去除受試物，肉眼觀察并記錄涂藥部位有無紅斑、水腫等反應(yīng)。結(jié)果參照文獻(xiàn)［5-8］進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)及刺激強(qiáng)度評(píng)分。上述各組動(dòng)物均在單次或多次給藥試驗(yàn)結(jié)束后，取給藥局部皮膚組織，甲醛固定，HE染色后進(jìn)行光鏡檢查。

2.2 主動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)［3，8-12］取豚鼠24只，雌雄各半，于給藥前24 h小心剪盡動(dòng)物背部左右兩側(cè)被毛，去毛區(qū)為4 cm×4 cm，試驗(yàn)前隨機(jī)分為3組，每組8只：溶媒對(duì)照組 （75%乙醇）、紫金透骨噴霧劑受試物組 （原藥液）及陽性對(duì)照組 （1%2，4-二硝基氯代苯溶液），每組8只。實(shí)驗(yàn)分兩步進(jìn)行。

第一步，致敏接觸：各組豚鼠左側(cè)去毛皮膚上分別給予0.2 m L受試物溶液，并使其分布均勻。給予藥物后，用紗布和膠帶覆蓋固定，確保使供試品與皮膚接觸6 h，溫水洗去受試藥物。第7天和第14天重復(fù)接觸致敏。

第二步，激發(fā)接觸：末次接觸致敏后14 d，在豚鼠右側(cè)去毛皮膚上按上法分別涂抹0.2 mL各組供試品激發(fā)接觸，陽性對(duì)照藥用0.1%的2，4-二硝基氯代苯溶液，同上法操作。6 h后去除供試品，溫水洗去受試藥物，即刻觀察，并于24、48、72 h再次觀察有無皮膚紅斑、水腫等過敏反應(yīng)指征。結(jié)果參照文獻(xiàn)［8，10-12］進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3 局部皮膚給藥急性毒性試驗(yàn)［3，9，13-15］取兔24只，雌雄各半，試驗(yàn)前24 h將動(dòng)物背部以電剪去毛，去毛面積約為15 cm×10 cm，并隨機(jī)分為破損皮膚和完整皮膚兩組。破損皮膚組動(dòng)物試驗(yàn)，以75%乙醇消毒脫毛區(qū)皮膚，然后用消毒刀片劃出 “#”型傷口，傷口占滿脫毛區(qū)，深度以皮膚輕度滲血為度，完整皮膚組動(dòng)物皮膚應(yīng)保持完好無損。

采用24 h內(nèi)4次的給藥方式 （每次2.5 mL/kg），受試藥物直接以最大劑量 （原藥液）和最大給藥容積給予 （10 mL/kg，每次分量涂抹防止流淌，保證藥液充分作用于給藥皮膚局部，然后用消毒紗布和網(wǎng)孔尼龍繃帶固定），對(duì)照組給予等量蒸餾水，給藥后保證藥液均勻分布于整個(gè)去毛區(qū)。給藥前用無菌紗布蘸溫水擦拭皮膚殘留藥物。24 h后溫水擦凈皮膚殘留藥物，觀察1、24、48、72 h直至14 d動(dòng)物的毒性反應(yīng)和死亡情況，記錄各組動(dòng)物的一般生理狀況、行為活動(dòng)、眼和黏膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、體質(zhì)量、進(jìn)食、大小便等有否中毒表現(xiàn)和死亡情況；觀察涂藥皮膚給藥局部有無紅斑、水腫等反應(yīng)，參照文獻(xiàn)［5-8］進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)及刺激強(qiáng)度評(píng)分。試驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物處死進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 皮膚刺激性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單次、多次給紫金透骨噴霧劑后，完整皮膚各劑量組評(píng)分均為 “0”；對(duì)破損皮膚，3個(gè)劑量平均反應(yīng)分值在1 h均大于0.5，但低于2.99，表明本品對(duì)破損皮膚有輕度刺激性。單次給藥后24 h后，刺激性明顯消退，平均反應(yīng)分值均小于0.5，各劑量組給藥后48 h刺激性消失，觀察結(jié)果見表1。多次給藥后24 h后，中、低劑量組刺激性明顯消退，平均反應(yīng)分值均小于0.5，各劑量組給藥后48 h刺激性消失。觀察結(jié)果見表2。溶媒對(duì)照組均未表現(xiàn)出刺激性。

3.2 主動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn) 紫金透骨噴霧劑及溶媒對(duì)照組豚鼠激發(fā)接觸72 h內(nèi)觀察，皮膚無紅斑及水腫現(xiàn)象出現(xiàn)，其反應(yīng)級(jí)數(shù)平均值為0，致敏率均為0；陽性對(duì)照組紅斑、水腫和致敏率在72 h內(nèi)表現(xiàn)為不同級(jí)別反應(yīng)指征。結(jié)果見表3。

3.3 局部皮膚給藥急性毒性試驗(yàn) 觀察14 d內(nèi)動(dòng)物死亡情況和全身中毒表現(xiàn)。試驗(yàn)期內(nèi)無一動(dòng)物死亡，觀察發(fā)現(xiàn)各給藥組動(dòng)物無異常表現(xiàn)［13］；紫金透骨噴霧劑最大耐受量給藥皮膚刺激反應(yīng)試驗(yàn)中，完整皮膚各劑量組評(píng)分均為“0”，破損皮膚的平均反應(yīng)分值在1 h內(nèi)表現(xiàn)出中度刺激性，給藥后24 h后，刺激性明顯消退，表現(xiàn)為輕度刺激性，72 h后刺激性完全消失。溶媒對(duì)照組均未表現(xiàn)出刺激性。結(jié)果見表4～6。

表1 單次給藥皮膚刺激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果 （n=8）

表2 多次皮膚刺激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果 （n=8）

表3 皮膚過敏實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果 （n=8）

表4 完整皮膚最大耐受量給藥體質(zhì)量及死亡情況 （n=3）

表5 破損皮膚最大耐受量給藥體質(zhì)量及死亡情況 （n=3）

表6 最大耐受量給藥皮膚刺激反應(yīng)試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果 （n=3）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)均參照 《中藥、天然藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和相關(guān)文獻(xiàn)［3-9］進(jìn)行，結(jié)果證實(shí)紫金透骨噴霧劑對(duì)豚鼠和日本大耳白兔完整皮膚無刺激性、對(duì)破損皮膚有可逆的輕微刺激性作用，對(duì)豚鼠無皮膚過敏反應(yīng)。在局部給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)時(shí)，為保證足夠的受試劑量，紫金透骨噴霧劑已達(dá)到最大劑量和給藥容積，故預(yù)試驗(yàn)中未測出LD50，僅以最大給藥量3 g生藥/（kg·d）-1進(jìn)行試驗(yàn)測定，相當(dāng)于臨床日用量的120倍，這提示本品毒性較低；并且通過觀察動(dòng)物短期內(nèi)接觸本品，亦可見其無皮膚急性毒性。說明紫金透骨噴霧劑是一種安全性較高的外用制劑，臨床用于治療氣滯血瘀型急性閉合性軟組織損傷，局部腫脹、刺痛，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等癥是安全的。

［1］ 何 迅，龐秀清，王永林，等.紫金透骨噴霧劑抗炎鎮(zhèn)痛活血化瘀作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（10）：2493-2495.

［2］ 何 迅，李勇軍，王愛民，等.多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選紫金透骨噴霧劑滲漉提取工藝［J］.中成藥，2010，32（6）：1061-1065.

［3］ 陳 奇.中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版.北京：人民衛(wèi)生版社，2006：159-161.

［4］ 唐祖年，李勇文，李園園.鮮毛膏菜皮膚刺激性研究［J］.中成藥，2011，33（9）：1594-1595.

［5］ 《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則 ［S］.北京：國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)

中心.2005：11-20.

［6］ 李 琛，李 杰，范彥博，等.“冬病夏治”黑膏藥制劑的皮膚刺激性和過敏性研究［J］.臨床合理用藥，2014，7（5）：105-107.

［7］ 鄧麗琴.復(fù)方咪康唑乳膏豚鼠皮膚刺激性試驗(yàn)觀察［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24（20）：3016-3017.

［8］ 歐余航，李 杰，陳 強(qiáng).九節(jié)茶腫痛寧乳膏鎮(zhèn)痛抗炎及皮膚刺激和過敏性作用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（14）：1118-1121.

［9］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第3版.北京人民衛(wèi)生出版社，2002：234-238.

［10］ 王 榮，顧 宜，張?zhí)依?，?高原護(hù)唇膏多次皮膚給藥的刺激性及過敏性研究［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（5）：586-588.

［11］ 賴東梅，張丹霞，陳惠英，等.咪康唑莫米松皮膚成膜凝膠皮膚用藥安全性試驗(yàn)［J］.中國藥業(yè)，2013，22（24）：22-23.

［12］ 《中藥、天然藥物免疫毒性 （過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究 的技術(shù)指導(dǎo)原則 ［S］.北京：國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心.2005：11.

［13］ 《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 ［S］.北京：國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心.2005：2-8.

［14］ 章建華，尹 華，劉云飛，等.三黃散瘀巴布劑的急性毒性皮膚刺激性和皮膚致敏實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（12）：1574-1576.

［15］ 苗 杰，王愛武，楊 柳，等.鹽酸普萘洛爾乳膏的安全性考察［J］.安徽醫(yī)藥，2014，18（6）：1020-1023.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2749-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.038

2015-01-12

貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目 （黔科合中藥字 ［2013］5062號(hào)；黔科合重G字 ［2013］4001）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃 （黔教合協(xié)同創(chuàng)新字 ［2013］04）

羅媛 （1982—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幩幋鷦?dòng)力學(xué)、活性物質(zhì)基礎(chǔ)與藥物新劑型

*通信作者：黃 勇 （1976—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幓钚晕镔|(zhì)基礎(chǔ)及藥動(dòng)學(xué)研究與藥物新劑型、新技術(shù)。Tel：（0851）6908468，E-mail：mailofhy@126.com