張　婷王瑞花于忠山

（1　中國(guó)刑警學(xué)院　遼寧　沈陽　110035；2　公安部物證鑒定中心　北京　100038）

頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定血中一氧化碳

張婷1王瑞花2于忠山2

（1中國(guó)刑警學(xué)院遼寧沈陽110035；2公安部物證鑒定中心北京100038）

詳細(xì)考察了頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-GC-MS）分析方法測(cè)定血中一氧化碳的多種影響因素，包括頂空體積、加熱溫度、加熱時(shí)間、加酸方式、制備飽和血樣的方法等內(nèi)容。同時(shí)對(duì)相同案件檢材的HS-GC-MS分析方法與常規(guī)分光光度法進(jìn)行比較，得出HS-GC-MS檢測(cè)一氧化碳的注意事項(xiàng)，以及其對(duì)腐敗檢材測(cè)定更具優(yōu)勢(shì)的結(jié)論。

一氧化碳頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法醫(yī)毒物分析

一氧化碳（CO）與血紅蛋白高度的親和力使血液失去攜氧功能，極易造成組織缺氧而引起人的急性中毒或死亡，這類案件時(shí)有發(fā)生。因此，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)血中碳氧血紅蛋白含量是判定一氧化碳中毒程度的關(guān)鍵。血中一氧化碳檢測(cè)常用的方法有分光光度法和紫外導(dǎo)數(shù)分光光度法，方法具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但分光光度法在計(jì)算過程中需應(yīng)用不同的經(jīng)驗(yàn)公式來計(jì)算含量，因此，分光光度法對(duì)于血液的新鮮程度依賴程度較高。HS-GC-MS是色譜分析法，已報(bào)道的文獻(xiàn)中證明了該法具有靈敏度高、線性范圍寬、適合腐敗血液、多種生物臟器組織檢材等優(yōu)點(diǎn)。[1-4]但HS-GC-MS法若想在實(shí)踐工作中作為標(biāo)準(zhǔn)方法來使用，還需要對(duì)影響HS-GC-MS定量分析的影響因素進(jìn)一步考察，還需要對(duì)同樣檢材的常規(guī)分光光度法測(cè)定與HS-GC-MS測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。因此，本文就上述內(nèi)容進(jìn)行研究，以期對(duì)血中一氧化碳的HS-GC-MS分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化操作提供借鑒。

1　材料和方法

1.1溶液配制

乳酸溶液：取乳酸12.5mL于帶蓋錐形瓶中，加去離子水37.5mL，混勻，即得25%乳酸溶液；血液稀釋劑：稱取0.25g連二亞硫酸鈉和0.093g三羥甲基氨基甲烷（THAM），加入100mL去離子水中，混勻。

1.2儀器條件

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1飽和血樣制備

取血樣，用去離子水1∶1稀釋后，取適量體積于頂空瓶中，加1-辛醇2～3滴，通入一氧化碳?xì)怏w30min，每隔2～3min，晃動(dòng)頂空瓶使一氧化碳制備均勻。30min后取頂空瓶在氮?dú)饬飨峦?～3min，以便去除血液中未結(jié)合血紅蛋白的CO氣體，密閉保存。

1.3.2檢材樣品制備

取檢血0.4mL(n=2或3)，加入12mL頂空瓶中，鋁蓋密封，再用1mL注射器抽取25%乳酸液0.5mL注入頂空瓶中，將密封的頂空瓶放入80℃加熱塊加熱10min后，準(zhǔn)確抽取0.3mL頂空氣體，迅速進(jìn)行GC/MS分析。

1.3.3對(duì)照樣品制備

取檢血0.4mL(n=2或3)，加入12mL頂空瓶中，按照“1.3.1飽和血樣制備”方法，通入一氧化碳?xì)怏w至檢血飽和，用鋁蓋密封后，余下步驟按照1.3.2等操作過程，準(zhǔn)確抽取0.3mL頂空氣體，迅速進(jìn)行GC/MS分析。

2　結(jié)果與討論

2.1定量線性范圍

取HbCO飽和血與空白血按比例混合，配制成0%(空白血)、25%、50%、75%、100%濃度的HbCO血各1mL，余下步驟按照1.3.2操作，頂空制樣GC/MS分析。以濃度為橫坐標(biāo)x，以吸收峰面積為縱坐標(biāo)y，得y=1.0×107x+512270（r=0.9924，n=3）。

2.2實(shí)驗(yàn)條件考察

2.2.1飽和血樣的制備

通氣時(shí)間：取5份不同來源的空白血液分成5組，每1組空白血再分成4個(gè)水平，每個(gè)水平通CO氣體時(shí)間不同，分別為5min、10min、15min、30min和40min，通氣體操作同1.3.1。將通好CO的血檢材，平行操作分裝到12mL頂空瓶中，余下操作同1.3.2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著通氣時(shí)間延長(zhǎng)，CO峰面積測(cè)值呈上升趨勢(shì)，5～15min通氣時(shí)間明顯不足，30～40min通氣時(shí)間測(cè)量結(jié)果變化不大，證明達(dá)到飽和血樣制備的要求。這與文獻(xiàn)[2]中報(bào)道的通CO氣體10～20min即可達(dá)到飽和的結(jié)果不相符，主要原因分析可能是本文采用石英毛細(xì)管通CO，CO氣泡控制較小，造成反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。

飽和程度的判定：一氧化碳飽和血樣的制備是頂空-氣質(zhì)定量測(cè)定的關(guān)鍵性步驟，通常將檢材血通CO一段時(shí)間，以其作為參比，測(cè)定值當(dāng)作飽和值，如果通氣過程達(dá)不到飽和程度，會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏高，準(zhǔn)確性遭到質(zhì)疑，用檢材飽和血來制作參比，可以消除血色素和腐敗的影響，但是以HS-GC-MS法測(cè)定來判定碳氧血紅蛋白飽和程度，操作方法耗時(shí)，對(duì)血液的需求量也較大，因此本文借用了紫外分光光度法，快速評(píng)價(jià)飽和血的測(cè)定方法。

這種方法將通CO的血液每隔5min取出1～2滴，用血液稀釋劑以1∶200的倍數(shù)稀釋，在500～600nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定538nm和555nm處的吸收光值，按照文獻(xiàn)[5]中的經(jīng)驗(yàn)公式，新鮮血液的（A538/A555）100=1.23左右即認(rèn)定飽和，或者是在500～600nm范圍內(nèi)掃描的峰型圖形不發(fā)生改變且（A538/A555）100比值保持不變，也可以認(rèn)定血液達(dá)到飽和程度。

2.2.2頂空熱塊加熱時(shí)間

加熱時(shí)間：頂空瓶采取熱塊加熱的方式，首先將熱塊溫度設(shè)定為80℃，接下來取4組頂空瓶，每組3瓶，依次在每個(gè)頂空瓶中加入0.4mLHbCO飽和血，密封頂空瓶，加熱前用注射器注入25%乳酸0.5mL混勻，置熱塊加熱時(shí)間分別為5min，10min，15min和30min，進(jìn)樣比較。結(jié)果表明在該溫度下加熱時(shí)間10min足夠，時(shí)間延長(zhǎng)色譜峰吸收峰面積略有下降，但不顯著。

加熱溫度：本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)文獻(xiàn)[1、3]報(bào)道的方法中考察了熱塊溫度控制在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃(n=3)等情況下的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明加熱溫度從50～110℃，對(duì)其靈敏度幾乎不影響，為便于操作，本文選定80℃。

2.2.3加酸及加酸方式考察

酸的種類：在GC/MS定性定量分析中，是檢測(cè)檢材全血中的總CO量，需要加入一定量的酸使結(jié)合態(tài)HbCO變成游離態(tài)CO。本文比較了相同濃度的乳酸和磷酸，分2組，每組3瓶，按照1.3.2的操作方法，比較制備的飽和一氧化碳血液的HS-GC-MS法測(cè)定CO峰面積，結(jié)果未見明顯差異。乳酸屬于有機(jī)酸，其作用相對(duì)溫和，在熱塊加熱過程中緩慢釋放CO，不建議用強(qiáng)酸反應(yīng)，強(qiáng)酸會(huì)造成血液中蛋白質(zhì)變性、碳化等現(xiàn)象。

加酸方式：取3組頂空瓶，每組3瓶，依次在每個(gè)頂空瓶中加入0.4mL一氧化碳飽和血，第一組直接密封頂空瓶，在熱塊加熱前用注射器加入25%乳酸0.5mL；第二組加入25%乳酸0.5mL后密封頂空瓶，之后熱塊加熱；第三組是加入0.5mL乳酸于小玻璃瓶中，將小玻璃瓶放入頂空瓶后密封，臨用前混合。結(jié)果表明將乳酸置于小瓶中臨用前混合的效果最好，CO損失小，但操作稍微繁瑣。加酸后再密封頂空瓶的操作，其過程中會(huì)有CO氣體損失，在與密封后加酸的操作相比，CO的損失量約為11%。

酸的用量：頂空法分析中兩相間的體積變化對(duì)測(cè)定結(jié)果是有影響的，依據(jù)計(jì)算公式：

式中，A是待測(cè)物的氣相色譜峰面積；CG是頂空中的待測(cè)物的濃度；C0是液體樣品中待測(cè)物的初始濃度，K是分配系數(shù)；β是相量比。參數(shù)K的效率由提取溫度和β決定，是受兩相間（物質(zhì)）相對(duì)的體積量決定。對(duì)于一氧化碳這樣的一個(gè)分配系數(shù)比較大的分析物，相比β對(duì)峰面積影響不大。本文考察了乳酸加入體積分別為0.5mL和1.0mL，以及檢材體積為0.4mL和0.8mL，相對(duì)于12mL頂空瓶的總體積來說，β變化不大，體積的少量改變對(duì)測(cè)定結(jié)果未見影響。

2.2.4有關(guān)腐敗檢材的測(cè)定

近些年，關(guān)于腐敗檢材CO中毒的檢驗(yàn)經(jīng)常有，也有關(guān)于尸體中CO的分布及代謝的研究報(bào)道。[6]文獻(xiàn)中建立的家兔CO中毒致死模型中，取中毒的新鮮血和室溫、4℃、-20℃下放置45天的腐敗血進(jìn)行間斷性的HS-GC-MS測(cè)定，盡管室溫放置的檢材均已發(fā)黑變臭，但45天后仍能檢測(cè)到CO含量最低為8.1%。[1、3]盡管這樣的數(shù)據(jù)不能解釋CO的產(chǎn)生是由于吸入還是由于死后微生物的分解所產(chǎn)生，但至少說明腐敗的血液和CO含量低于10%的檢材血液仍能用HS-GC-MS法進(jìn)行測(cè)定。此外，還要提醒的是較低含量的CO鑒定，在出具檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)要慎重，長(zhǎng)期吸煙的人、交通警察、部分地區(qū)的女性，其體內(nèi)CO的含量也接近10%。[7]

2.3HS-GC-MS法與分光光度法比較

選擇5份一氧化碳中毒檢材，HS-GC-MS分析時(shí)按照1.3.2和1.3.3的操作，分光光度法分析時(shí)按照《中國(guó)刑事科學(xué)技術(shù)大全毒物與毒品檢驗(yàn)》[8]中的一氧化碳測(cè)定法操作，結(jié)果如表所示。

表　不同方法測(cè)定中毒檢材血液中一氧化碳含量（%）

結(jié)果表明，對(duì)于一氧化碳中毒含量在50-60%時(shí)，幾種方法測(cè)定結(jié)果差別不大，通常這一濃度也是判定一氧化碳中毒死亡原因的濃度，但當(dāng)檢材保存不當(dāng)、中毒量濃度不高時(shí)，幾種方法差別較大，另外分光光度法無法對(duì)凝固的、腐敗的血液，臟器檢材進(jìn)行測(cè)定。

綜上，一氧化碳中毒血的HS-GC-MS法檢測(cè)是一種相對(duì)穩(wěn)定的測(cè)定方法，其線性范圍較寬，更適合于血液、臟器、組織等檢材操作，但HS-GC-MS法測(cè)定的是血液中的總一氧化碳的含量，不排除組織等檢材中微量的、正常水平的一氧化碳的干擾。

[1]郝紅霞，于忠山，王炯，等．頂空氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定腐敗血、肝檢材中CO[J]．中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（6）：340-341.

[2]于忠山．頂空氣相色譜法測(cè)定生物組織中的一氧化碳[J]．中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，1992，7（3）：155-158.

[3]Hao H,Zhou H,Liu X,etal.An accurate method formicroanalysisofcarbon monoxidein putridpostmortem blood by head-space gaschromatography-mass spectro metry(HS/GC/MS)[J].Forensic Sci Int.,2013,229(1-3): 116-121.

[4]Varlet V,De Croutte EL,Augsburger M,et al. Accuracy profile validation of a new method for carbon monoxide measurement in the humanblood using headspace-gaschromatography-massspectrometry (HS-GC-MS)[J].J Chromatogr B， 2012， 880(1): 125-131.

[5]陳燾．毒理學(xué)教材[M]．第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：78-82.

[6]Vassiliki A.Boumba,Theodore Vougiouklakis. Evaluation of the Methods Used for Carboxyhemoglobin Analysis in Postmortem Blood[J].International Journal of Toxicology，2005，24:275-281.

[7]王海玲，李君，王利民．唐山市交通廢氣污染對(duì)交通警察HBCO飽和度的影響[J]．中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2004，13（2）：79-80.

[8]劉文．中國(guó)刑事科學(xué)技術(shù)大全（毒品和毒物檢驗(yàn)）[M]．北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2003：698-700.

（責(zé)任編輯：于萍）

D918.93

A

2095-7939(2015)01-0075-03

2014-10-27

張婷（1975-），女，遼寧沈陽人，中國(guó)刑警學(xué)院法化學(xué)系講師，碩士，主要從事刑事毒物毒品分析研究。