王曉波(綜述)，鄭　欣 ，陳一心※(審校)

(1.東南大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院骨科，南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院骨科，南京 210008)

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感染性骨缺損動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

王曉波1△(綜述)，鄭欣2，陳一心2※(審校)

(1.東南大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院骨科，南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院骨科，南京 210008)

摘要：感染性骨缺損是指骨缺損的同時(shí)伴有感染而導(dǎo)致骨不愈合，其治療是臨床一大難題。近年來，隨著生物載體材料的研究，感染性骨缺損的骨組織工程治療方法不斷深入，如何更好地建立感染性骨缺損模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的研究有至關(guān)重要的作用。建立感染性骨缺損動(dòng)物模型需要選擇細(xì)菌種類及劑量、動(dòng)物種類和骨缺損的部位，而不同的動(dòng)物及骨缺損部位所需的細(xì)菌劑量不同，合適的選擇對(duì)骨組織工程的研究結(jié)果影響極大。

關(guān)鍵詞：感染；骨缺損；動(dòng)物模型

隨著交通事故的頻繁發(fā)生，各種開放性骨折日益增加，由于其通常伴有感染和骨缺損而導(dǎo)致骨不愈合，其治療是骨科臨床中的一大難題[1-3]。感染性骨缺損是指骨缺損的同時(shí)伴有感染，其病因和治療是目前矯形外科的研究熱點(diǎn)。感染性骨缺損動(dòng)物模型的建立為其提供了有效的研究方法，可為感染性骨缺損的臨床治療提供指導(dǎo)和依據(jù)。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用在慢性骨髓炎模型的基礎(chǔ)上清創(chuàng)制造骨缺損的方法構(gòu)建感染性骨缺損模型[4-6]。現(xiàn)就感染性骨缺損動(dòng)物模型的研究進(jìn)展予以綜述。

1感染性骨缺損動(dòng)物模型的細(xì)菌種類

1.1金黃色葡萄球菌人類骨感染中，以金黃色葡萄球菌最為多見[7-8]，因此感染性骨缺損動(dòng)物模型最常采用金黃色葡萄球菌[9-11]。根據(jù)來源不同，可直接使用在患者感染部位分離出的菌株，Lucke等[12]在慢性骨髓炎患者體內(nèi)分離出對(duì)氟氯霉素、慶大霉素和紅霉素敏感但對(duì)青霉素有耐藥性的金黃色葡萄球菌用于制作鼠感染性骨缺損模型。而更多人則采用標(biāo)準(zhǔn)的美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)菌株，常用的有ATCC29213[13-14]、ATCC49525[5-15]、ATCC25923[9,16]、ATCC33591(即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)[10,17]等。李云飛等[17]在國內(nèi)率先使用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌制作新西蘭大白兔脛骨慢性骨髓炎模型，模型成功率為92.5%，表現(xiàn)為慢性活動(dòng)性炎癥，效果較滿意。Xing等[9]在新西蘭兔脛骨結(jié)節(jié)用3 mm克氏針鉆孔注入金黃色葡萄球菌ATCC25923，4周后即出現(xiàn)死骨形成、骨膜反應(yīng)、骨質(zhì)破壞、骨硬化、軟組織腫脹等骨感染表現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)前確定細(xì)菌的正確劑量尤為必要，否則可能導(dǎo)致感染率低或細(xì)菌數(shù)量太多，毒血癥反應(yīng)嚴(yán)重，動(dòng)物病死率高[4]。不同動(dòng)物、不同部位所需細(xì)菌接種量不同[13-17]。Horn等[18]制備兔脛骨感染性骨缺損模型時(shí)，使用4×104菌落形成單位(Colong forming unitsk,CFU)金黃色葡萄球菌，所有的動(dòng)物均未形成感染；當(dāng)使用6×106CFU 細(xì)菌劑量，所有動(dòng)物均出現(xiàn)嚴(yán)重的骨感染癥狀。唐輝和徐永清[13]選用6月齡新西蘭大白兔在其脛骨骨面，以3 mm 克氏針鉆孔制備0.5 cm×0.5 cm骨窗，注入不同濃度的ATCC29213，探討細(xì)菌注射量與感染進(jìn)程的關(guān)系；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌注射劑量≥6×105CFU可出現(xiàn)明顯的放射學(xué)和細(xì)菌學(xué)改變，而<6×104CFU則只有輕微感染，因此認(rèn)為6×105CFU可作為兔脛骨慢性感染性骨缺損模型制備適合劑量。Chen等[19]在大鼠股骨制造6 mm骨缺損后，分別接種1×103、1×104、1×105、1×106CFU的金黃色葡萄球菌，接種2個(gè)月后只有1×104CFU能較好地形成節(jié)段性骨缺損感染模型且不影響固定裝置的穩(wěn)定性，4周后1×105、1×106CFU固定裝置穩(wěn)定性受到明顯影響而1×103CFU感染率較低。然而，Passl等[20]認(rèn)為細(xì)菌濃度的影響有限，細(xì)菌及其產(chǎn)物能改變感染部位的微環(huán)境促進(jìn)細(xì)菌增殖，他們用1×104CFU的金黃色葡萄球菌即成功地在豚鼠股骨建立感染性骨缺損模型。同樣的，Lindsey等[4]發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨接種細(xì)菌量在1×102CFU金黃色葡萄球菌即能達(dá)到理想的90%~100%的感染率且不會(huì)發(fā)生敗血癥。

1.2大腸埃希菌和銅綠假單胞菌臨床中還可見其他微生物感染的骨感染(如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等)。為驗(yàn)證大腸埃希菌是否具有與金黃色葡萄球菌相同的誘導(dǎo)骨感染的能力，Passl等[20]用電鋸截?cái)?只豚鼠股骨，接種1×105CFU大腸埃希菌，4周后出現(xiàn)明顯的骨感染表現(xiàn)，90 d后細(xì)菌學(xué)檢查6只豚鼠無細(xì)菌感染，1只有大腸埃希菌和銅綠假單胞菌混合感染，表明細(xì)菌產(chǎn)物導(dǎo)致的局部炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素和免疫微環(huán)境變化等可促進(jìn)其他細(xì)菌進(jìn)入感染部位。Kanellakopoulou等[21]從慢性骨髓炎患者分泌物中分離出銅綠假單胞菌，在31只兔脛骨上段接種，制作感染性骨缺損動(dòng)物模型，接種細(xì)菌2周后局部出現(xiàn)腫脹，16只兔有化膿性竇道形成，49 d后只有25只兔出現(xiàn)骨感染表現(xiàn)并伴有死骨形成，其余11只無明顯感染。該研究表明，銅綠假單胞菌也可作為制作感染性骨缺損模型的菌種，但其模型的成功率較低。

1.3混合細(xì)菌臨床患者常出現(xiàn)混合感染，為模擬混合細(xì)菌感染的動(dòng)物模型，Lambe等[22]使用表皮葡萄球菌和脆弱類桿菌混合感染兔脛骨后，使用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌主要分布在植入物表面，而脆弱桿菌主要分布于骨和骨髓。袁軍等[23]用金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合感染大鼠，發(fā)現(xiàn)低濃度的兩種細(xì)菌之間存在協(xié)同作用；在局部細(xì)菌水平低的情況下，銅綠假單胞菌可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的致病性。

2動(dòng)物種類

2.1大鼠盡管大鼠骨骼尺寸較小，但仍可進(jìn)行鉆孔、截?cái)嗪蛢?nèi)、外固定等操作。Henry和Galloway[24]認(rèn)為，大鼠比較適合用于感染性骨缺損的研究，因?yàn)槠溆邢鄬?duì)經(jīng)濟(jì)和耐受廣譜抗生素治療等優(yōu)點(diǎn)；但鼠的體積小，不能用于大型固定裝置的測試并且難以控制性靜脈使用抗生素。Kaya等[11]應(yīng)用大鼠脛骨感染性骨缺損模型，在大鼠脛骨平臺(tái)和脛骨結(jié)節(jié)之間用旋鉆做一深度約為1 cm的骨缺損管道，然后注入1×105CFU金黃色葡萄球菌100 μL；2 d后大鼠脛骨部位出現(xiàn)明顯的紅腫熱痛表現(xiàn)，約21 d后大鼠脛骨X線可見軟組織腫脹、骨亮度增強(qiáng)、骨組織破壞、骨膜反應(yīng)及皮質(zhì)骨溶解等骨感染表現(xiàn)，每克骨組織的細(xì)菌數(shù)量達(dá)51×105CFU。Hamblen[25]發(fā)現(xiàn)大鼠脛骨感染性骨缺損模型中，僅接種細(xì)菌時(shí)感染率較低，約為64%，但開放接種并置入外科血纖維泡沫后，其感染率可達(dá)85%。大鼠股骨還可制作節(jié)段性感染性骨缺損模型，Penn-Barwell等[15]用電鋸從股骨中段截?cái)? mm，接種1×102CFU 金黃色葡萄球菌和60 mg/mL牛血清蛋白0.5 mL，模擬開放骨折的感染機(jī)制，成功建立節(jié)段性感染性骨缺損動(dòng)物模型。

2.2兔An等[26]認(rèn)為，新西蘭大白兔體形適中、價(jià)格便宜且脛骨前僅有皮膚覆蓋，手術(shù)操作方便，適宜作為骨感染研究的模型動(dòng)物。此外，兔的長骨具有更容易感染的特點(diǎn)，且兔骨骼尺寸相對(duì)較大，可作為感染性骨缺損的部位也較多，每個(gè)部位有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)[27]。兔顱骨較厚，其板狀骨比較適合建立骨缺損面積較大的模型，Smith等[28]在兔顱骨建立15 mm×15 mm的大段骨缺損模型，觀察6周后，骨缺損無明顯修復(fù)。劉冰和陳鵬[16]在兔顱骨上制成直徑為10 mm的顱骨全層缺損區(qū)，缺損區(qū)植入β-磷酸三鈣，在每塊植入物上均勻滴加1.5×108CFU/mL金黃色葡萄球菌液l mL，手術(shù)成功率為100%；術(shù)后2周缺損區(qū)軟組織有明顯腫脹及膿性滲出，并有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤和微小膿腫形成等骨感染表現(xiàn)。兔顱骨還可在左右側(cè)各建立骨缺損模型進(jìn)行自身對(duì)照，Yew等[29]在兔顱骨左右各鉆一直徑為8 mm的顱骨全層缺損區(qū)，用于對(duì)比研究自體間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于骨缺損的修復(fù)。兔脛骨最早用于建立感染性骨缺損模型，具有手術(shù)暴露簡單且骨缺損斷端穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[30]。Borzsei等[31]在脛骨近端前面作一4 mm×8 mm的骨缺損，接種1×109CFU金黃色葡萄球菌，并將自體失去活性的骨碎片植入骨髓腔促進(jìn)感染；4周后，6只兔死于感染并發(fā)癥，19只兔成功建立感染性骨缺損模型。高秋明等[32]在脛骨近側(cè)干骺端內(nèi)側(cè)1.5 cm處制作長半環(huán)形骨缺損并接種細(xì)菌制作骨髓炎模型，4周后僅能觀察到骨質(zhì)疏松，8周后才能觀察到化膿性竇道、死骨形成等骨感染表現(xiàn)。相對(duì)于脛骨，股骨能更好地承載植入物。Schroeder等[10]在6只新西蘭大白兔距髕股關(guān)節(jié)背側(cè)5 mm處和膝關(guān)節(jié)5 mm處的中心，制成一直徑4 mm的骨缺損，接種金黃色葡萄球菌，并將直徑4.1 mm、長5 mm表面鈦涂層的圓柱狀植入物植入脛骨遠(yuǎn)端；通過細(xì)菌學(xué)檢查等方法觀察到，約7周后，5只兔可見細(xì)菌培養(yǎng)陽性、化膿性竇道等骨感染表現(xiàn)，1只死于膿毒性血癥。兔前臂橈骨和尺骨解剖學(xué)融合在一起，可以比較完整地進(jìn)行截骨手術(shù)建立節(jié)段性骨缺損模型，而不需要內(nèi)固定或外固定，這種模型較為接近人類的感染性骨缺損的臨床實(shí)際[33]。Evans等[34]用電鋸在新西蘭兔橈骨中段截取1 cm制造節(jié)段性骨缺損，接種1×108CFU金黃色葡萄球菌，用死骨促進(jìn)感染，約4周后感染性骨缺損模型成功率為93%。李東亞等[33]采用計(jì)算機(jī)斷層掃描研究分析6月齡兔橈骨大段骨缺損模型的合理骨缺損長度及缺損位置，結(jié)果表明，兔橈骨大段骨缺損模型的缺損長度選擇1.5 cm較為合適，且缺損位置選擇在橈骨中段或者近段均可。

2.3犬和豬大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昂貴、實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)要求高、手術(shù)操作難度大，但也有很多優(yōu)點(diǎn)(如與人的生物同源性近、體積大等)。Wahlig等[35]建立了經(jīng)典的犬股骨感染性骨缺損模型，在股骨轉(zhuǎn)子窩鉆孔后吸取2 mL骨髓，將1×108CFU的金黃色葡萄球菌注入骨髓腔，5~7周后出現(xiàn)溶骨反應(yīng)等骨感染表現(xiàn)，建模的成功率為58.3%。Patterson等[36]在8只豬下頜骨鉆孔，用電烙術(shù)制造骨壞死，然后向骨髓腔內(nèi)注入金黃色葡萄球菌1×109~1×1010CFU，8周后所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均有溶骨反應(yīng)、化膿性竇道形成等骨感染臨床表現(xiàn)。

3小結(jié)

在研究感染性骨缺損發(fā)病機(jī)制及治療方法的過程中，很多學(xué)者采用多種方法在大小動(dòng)物中建立了感染性骨缺損的動(dòng)物模型，如何更好地制備感染性骨缺損的動(dòng)物模型仍需要大量實(shí)驗(yàn)研究。感染性骨缺損手術(shù)的選擇方式(如：先制作骨感染再行清創(chuàng)術(shù)形成缺損、先做缺損再感染等)、術(shù)中是否加入易感染因素(如：加入死骨、開放傷口、軟組織破壞等)等均對(duì)感染性骨缺損動(dòng)物模型建立的成功率有至關(guān)重要的影響。隨著研究的深入，相信會(huì)有更為理想的模型，進(jìn)一步推動(dòng)感染性骨缺損發(fā)病機(jī)制和有效治療方法的探索。

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Advancement of Animal Models for Infective Bone Defect

WANGXiao-bo1,ZHENGXin2,CHENYi-xin2.

(1.DepartmentofOrthopedics,DrumTowerClinicalMedicalSchoolofSoutheastUniversity,Nanjing210008,China; 2.DepartmentofOrthopedics,DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China)

Abstract:The infective bone defect refers to the situation of bone defect combined with infection which results in the nonunion of the bone,and the treatment is still a difficulty in clinical.In recent years,along with the research of biological carrier material,the bone tissue therapeutic method for the infective bone defect has been continuously deepening,and developing an appropriate animal model is very important for thestudy.While considering a specific model,one should take the bacterial species,bacteria groups and numbers,and bone defect site into account.Different bacteria amounts are needed for different animals and positions,and appropriate choices have significant impact on the study result.

Key words:Infection; Bone defect; Animal model

收稿日期：2014-06-05修回日期：2014-08-23編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：江蘇省社會(huì)發(fā)展基金(BE2011604)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2012-WS-092)；南京市衛(wèi)生局一般項(xiàng)目(YKK13079，ZKX12016)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.07.003

中圖分類號(hào)：R332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)07-1158-04