于洪蛟 徐 林 張立陽 李永華 梁洪生 張相彤

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羊膜的結(jié)構(gòu)功能特性和臨床應(yīng)用

于洪蛟 徐 林 張立陽 李永華 梁洪生 張相彤

經(jīng)過多年的研究，可以了解羊膜的組織結(jié)構(gòu)和功能特性，特別是羊膜來源細(xì)胞的多向分化潛能。羊膜含有多種生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性、非致瘤性等特性。羊膜移植生物相容性好，能促進(jìn)上皮再生、減輕不良反應(yīng)，并且無倫理爭(zhēng)議等。羊膜臨床應(yīng)用廣泛，特別是在治療眼表疾病、皮膚損傷、膜性組織損傷等方面。隨著研究深入，羊膜在抗腫瘤上也嶄露頭角，如羊膜來源細(xì)胞能抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡等，值得進(jìn)一步研究。

羊膜 特性 臨床應(yīng)用 抗腫瘤

羊膜是胎盤的最內(nèi)層光滑、無血管、神經(jīng)及淋巴的半透明薄膜，作為一種良好的生物材料，羊膜因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)功能屬性已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床。早在20世紀(jì)初，就有文獻(xiàn)報(bào)道將羊膜應(yīng)用于皮膚移植，治療皮膚燒傷和潰瘍。隨著研究的深入，羊膜移植在眼表重建、皮膚損傷修復(fù)中取得了突破性進(jìn)展。近年來，羊膜被認(rèn)為是一種治療與眼、口腔、皮膚、泌尿生殖道等相關(guān)疾病的新策略，在抗腫瘤方面也逐漸被人們所關(guān)注[1，2]。本文重在介紹羊膜的結(jié)構(gòu)功能特性及常見的臨床應(yīng)用。

一、羊膜的結(jié)構(gòu)和功能

羊膜厚度約0.02～0.5mm，由內(nèi)向外由單層上皮層、薄的基膜層、厚的間質(zhì)層3層構(gòu)成[1,3]。上皮細(xì)胞呈立方形，核大而不規(guī)則，胞質(zhì)豐富，具有豐富的胞飲小泡和細(xì)胞器，表面有很多具有活躍的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的微絨毛。上皮細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞標(biāo)志物，如糖蛋白CA125、縮宮素受體，CD44和肌間絲蛋白抗原也呈陽性。人羊膜上皮細(xì)胞還表達(dá)促紅細(xì)胞生成素及其受體，在羊膜中的功能依然未知。基膜中含有大量的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，對(duì)羊膜高分子物質(zhì)起到滲透屏障作用，并與膜收縮蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白等共同維持著羊膜結(jié)構(gòu)的完整性。間質(zhì)層又可分為致密層、纖維細(xì)胞層和海綿層。致密層含有豐富的膠原纖維，纖維細(xì)胞層是主要由纖維母細(xì)胞組成的松散的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，海綿層含有豐富的蛋白聚糖、糖蛋白和Ⅲ型膠原蛋白,羊膜很容易在海綿層從絨毛膜層上鈍性分離[3]。

羊膜最基本的功能是保護(hù)胚胎/胎兒并為其發(fā)育提供適宜的懸浮液體環(huán)境，緩沖周圍的壓力使胎兒能自由的、活動(dòng)的生長(zhǎng)。羊膜含有的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白，使其能抵抗一定的張力，并具有一定的彈力。羊膜能轉(zhuǎn)運(yùn)多種可溶性物質(zhì)，并能合成分泌多種生物因子，如血管活性肽、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等。懷孕期間羊膜上皮細(xì)胞代謝活躍，對(duì)于維持羊水恒定的pH值有重要作用。在分娩時(shí)羊膜也具有重要作用，前列腺素是誘發(fā)子宮收縮的主要內(nèi)源性因子，起著誘發(fā)破膜、啟動(dòng)和維持宮縮等作用，羊膜高表達(dá)前列腺素合成酶的關(guān)鍵酶，可以合成高濃度的前列腺素[4]。

二、羊膜的特性

1.羊膜細(xì)胞的多向分化潛能:羊膜細(xì)胞主要是由來源于外胚層的上皮和來源于中胚層的間充質(zhì)兩類細(xì)胞構(gòu)成，表達(dá)與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物，如SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60和 TRA-1-81等，具有多向分化潛能，可誘導(dǎo)分化成為3個(gè)胚層不同類型的細(xì)胞，在細(xì)胞治療中有很大的應(yīng)用潛力[2]。(1)肝細(xì)胞：羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、角蛋白18等和其他肝細(xì)胞相關(guān)的基因。此外，在羊膜上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)參與肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)節(jié)基因肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子亞型3γ(HNF-3γ)和轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)。HNF-3γ主要誘導(dǎo)白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達(dá)，C/EBPα可調(diào)控糖原的儲(chǔ)存、白蛋白、甲胎蛋白、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)羊膜上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并表現(xiàn)出蛋白合成和分泌、糖原儲(chǔ)存、尿素的合成、細(xì)胞色素P450-3A4(CYP3A4)的表達(dá)、低密度脂蛋白的攝取等肝細(xì)胞功能，也表達(dá)一些參與脂肪、膽固醇、膽汁酸合成有關(guān)的基因[2，5]。以上表明，人羊膜上皮細(xì)胞和(或)羊膜移植可成為治療肝臟疾病的新途徑。(2)心肌細(xì)胞：成人心肌細(xì)胞幾乎沒有再生能力，細(xì)胞心肌成形術(shù)是治療嚴(yán)重心臟疾病的新方法。羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4，心肌特異性基因，如肌球蛋白輕鏈(MLC)-2a、MLC-2V、cTNI、cTNT、心臟特異性L-型鈣離子通道和外向瞬時(shí)鉀離子通道的α亞基。通過堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或激活素A等特定因子的刺激，羊膜間充質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.5)和心肌特異性標(biāo)志物(心房利鈉肽)[6]。GATA4和Nkx2.5調(diào)節(jié)心肌特異性基因的表達(dá)，是心肌前體細(xì)胞最早期的標(biāo)志，它們的激活意味著心肌細(xì)胞分化程序的啟動(dòng)。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞能夠融入心臟組織并有與心臟組織同步的自發(fā)收縮能力，表達(dá)心臟特異性標(biāo)志物[6]。(3)軟骨細(xì)胞：羊膜細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因，如SOX家族、骨形成蛋白(BMP)及其受體[2，7]。羊膜細(xì)胞在體外通過特定物質(zhì)的誘導(dǎo)后表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物COMP、AGC1、CSPG2、COL1A1、COL9A2、MIA等，并在培養(yǎng)基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖(GAG)的積累，具有典型的軟骨細(xì)胞的形態(tài)和功能特性，可成為骨組織工程的種子細(xì)胞[8]。羊膜細(xì)胞經(jīng)過PKH26標(biāo)記后與PLGA載體植入兔膝關(guān)節(jié)后，細(xì)胞能存活且有較好的生物相容性，顯示了羊膜細(xì)胞在治療軟骨疾病的潛在價(jià)值[7]。(4)胰島β細(xì)胞：胰島β細(xì)胞移植開辟了治療晚期糖尿病的新的途徑，然而常因供體細(xì)胞稀少而受限。研究報(bào)道，人羊膜上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為產(chǎn)生胰島素的功能細(xì)胞，表達(dá)多個(gè)胰島β細(xì)胞基因，在移植入鏈脲霉素誘發(fā)型糖尿病小鼠后，能合成和分泌胰島素，可使血糖水平正常化[9]。表明羊膜上皮細(xì)胞在體內(nèi)具有分化成胰島β細(xì)胞的潛力，對(duì)1型糖尿病有潛在的治療價(jià)值。(5)神經(jīng)細(xì)胞:羊膜細(xì)胞表達(dá)多種神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如波形蛋白、神經(jīng)纖絲蛋白等，還能以合成和釋放乙酰膽堿、兒茶酚胺、多巴胺、激活素、Noggin及各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[10]。人羊膜細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志物，并能分化成神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；移植入帕金森大鼠側(cè)腦室后，羊膜細(xì)胞能分化成酪氨酸羥化酶(TH)陽性細(xì)胞，改善大鼠的帕金森癥狀，并能促進(jìn)大鼠內(nèi)源性神經(jīng)再生[11]。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能誘導(dǎo)分化成神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞，表達(dá)更高水平的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，移植入體內(nèi)能促進(jìn)大鼠腦損傷的修復(fù)[10]。 (6)聽覺系統(tǒng)：體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核上表達(dá)間隙連接蛋白Cx26，在細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中還表達(dá)鈉鉀泵，此為耳蝸成纖維細(xì)胞的特有屬性，成纖維細(xì)胞維持著耳蝸的正常組織結(jié)構(gòu)和功能，表明羊膜上皮細(xì)胞有作為功能性成纖維細(xì)胞使用的可能。移植入豚鼠耳蝸后，羊膜上皮細(xì)胞能持續(xù)3周表達(dá)Cx26和鈉鉀泵，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)[12]。

2.抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性：羊膜具有抗炎、抗菌、抗病毒性和低免疫原性，是較理想的移植物。其機(jī)制尚未完全清楚。一方面，羊膜作為物理屏障，可阻止炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，并能吸引、誘捕炎性細(xì)胞，從而降低炎性介質(zhì)的釋放。羊膜移植后可防止死腔形成、減少分泌物的積聚，基質(zhì)的膠原纖維還具有止血效果，可防止術(shù)后血腫形成從而降低感染風(fēng)險(xiǎn)[1]。另一方面，羊膜表達(dá)一些抗菌肽，如防衛(wèi)素、彈力素及分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)等，具有抗炎、抗感染作用[13]。羊膜細(xì)胞能合成分泌多種抗炎因子，如IL-1和IL-2受體拮抗劑、內(nèi)皮抑制素等，減輕炎性反應(yīng)。羊膜上皮細(xì)胞的上清液可抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化活性，減少T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。此外，羊膜還表達(dá)一些基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，能抑制MMPs參與的炎性反應(yīng)、血管重建等病理反應(yīng)[1]。羊膜富含的膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，哺乳動(dòng)物同型膠原的氨基酸種類、排列、數(shù)目基本相同，具有良好的生物相容性。羊膜細(xì)胞表達(dá)免疫抑制因子CD59和HLA-G等，具有一定的免疫抑制功能。羊膜移植后免疫應(yīng)答微不足道，未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，似乎是無免疫原性的組織。然而關(guān)于羊膜免疫應(yīng)答的研究報(bào)道較少，對(duì)于新鮮羊膜和保存羊膜的免疫原性和臨床應(yīng)用仍然存在爭(zhēng)議，隨著研究應(yīng)用的深入，羊膜移植的免疫安全性也日益被人們所關(guān)注。

3.抗新生血管形成：人羊膜能抑制角膜新生血管的形成，降低角膜表面的血管化，對(duì)治療角膜疾病有很重要的作用。一方面可能為羊膜作為物理屏障可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而阻斷新生血管的形成。另一方面，羊膜基質(zhì)中含有大量的諸如層粘連蛋白-1、-5，纖連蛋白,膠原蛋白Ⅶ等，均參與抑制角膜新生血管的行成。此外，羊膜細(xì)胞還合成各種生物活性物質(zhì)，包括抗血管形成因子、內(nèi)皮抑素和血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)。TSP-1能抑制由VEGF或bFGF誘導(dǎo)的血管形成，內(nèi)皮抑素是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管形成抑制因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附，促進(jìn)凋亡、抑制促血管形成因子的生物學(xué)作用。羊膜能表達(dá)色素上皮衍生因子(PEDF)、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、IL-10等都能抑制血管形成的過程[14]。

4.促進(jìn)上皮生成和抗纖維化：羊膜能作為良好的細(xì)胞外基質(zhì)能增強(qiáng)上皮細(xì)胞的黏附、促進(jìn)增殖遷移、抑制凋亡，促進(jìn)上皮形成[15]。羊膜中存在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等促進(jìn)傷口愈合的生物活性物質(zhì)，特別是EGF和KGF，能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和遷移，在創(chuàng)口愈合中有重要作用。新鮮羊膜含有豐富的高分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸，不僅有利于細(xì)胞遷移，還具有一些抗炎和免疫抑制功能[1]。瘢痕組織的形成主要因成纖維細(xì)胞的過度增生，TGF-β能激活成纖維細(xì)胞，而羊膜能抑制TGF-β受體在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)從而抑制纖維化。角膜受損可引起角膜成纖維細(xì)胞的凋亡，激發(fā)角膜基質(zhì)細(xì)胞活化增生，引起一系列的角膜損傷修復(fù)反應(yīng)。羊膜可減輕由IL-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減輕角膜成纖維細(xì)胞的活化增生，在減輕角膜損傷的修復(fù)和抗瘢痕形成中有重要作用。由此可見，羊膜促進(jìn)創(chuàng)口的愈合是通過調(diào)控組織的重建而非促進(jìn)瘢痕組織的形成。

5.非致瘤性和無倫理爭(zhēng)議：羊膜上皮細(xì)胞缺乏端粒酶，無法在體外無限擴(kuò)增，克服了細(xì)胞移植后在宿主體內(nèi)致癌的可能，具有非致瘤性。至今為止，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中接受羊膜及羊膜細(xì)胞移植后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患者未有致瘤性報(bào)告。分娩后的胎盤通常是作為廢棄物處理的，羊膜的取材無倫理道德爭(zhēng)議，通過倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和捐贈(zèng)者的同意羊膜在臨床上應(yīng)用可以推廣。為了保證羊膜的質(zhì)量，捐贈(zèng)者必須經(jīng)過血清學(xué)檢驗(yàn)，保證無傳染性和惡性腫瘤疾病，建議選擇自愿的剖宮產(chǎn)婦女。

三、羊膜的臨床應(yīng)用

1.眼表重建：羊膜移植能重建眼表結(jié)構(gòu)、維持眼表穩(wěn)定，使受損的角膜或結(jié)膜快速上皮化，減少瘢痕形成，減輕炎性反應(yīng)，減輕瞼球粘連、抑制角膜血管化、提高視力等，在治療各種原因所致的眼表?yè)p傷、潰瘍、眼表腫瘤、難治性青光眼等疾病中取得了良好的效果，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。近年來，在治療限制性斜視上羊膜也逐漸獲得青睞，羊膜移植后能防止術(shù)后瘢痕形成、減輕偏向角、改善了轉(zhuǎn)向[15，16]。

2.皮膚修復(fù)：如何在治療燒傷、創(chuàng)傷、脈管系統(tǒng)疾病等患者的皮膚損傷中使傷口達(dá)到最佳愈合效果，一直是人們的研究焦點(diǎn)。羊膜輔料具有天然的生物基質(zhì)并含有一些生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗感染、促進(jìn)上皮再生、減輕疼痛、減少滲出等性能，臨床應(yīng)用于皮膚的修復(fù)均取得了良好效果，與其他輔料相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。特別是在治療慢性不愈創(chuàng)口上，羊膜能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)相關(guān)的炎性反應(yīng)，抑制組織的破壞，減少了傷口滲出和色素沉著，加速傷口的愈合[17]。

3.術(shù)后防粘連：Asherman綜合征是由于刮宮時(shí)損傷宮頸管黏膜或子宮內(nèi)膜基底層、肌層、局部創(chuàng)面形成而致粘連，臨床常見閉經(jīng)、月經(jīng)減少或不孕，多次人工流產(chǎn)、術(shù)后感染及術(shù)后卵巢功能低下易引起。首選治療方法為宮腔鏡，臨床研究報(bào)道，在宮腔鏡松解后應(yīng)用羊膜移植能顯著減少術(shù)后粘連復(fù)發(fā)和增強(qiáng)子宮內(nèi)膜再生[18]。

4.膜性組織修復(fù)：羊膜也被廣泛應(yīng)用于泌尿生殖道的修復(fù)和重建、口腔鼻腔黏膜的修復(fù)，有助于組織損傷的修復(fù)和功能的恢復(fù)。Koziak等[19]首次報(bào)道應(yīng)用羊膜進(jìn)行男性尿道的重建，對(duì)治療男性尿道狹窄提供了新的策略，隨后，羊膜應(yīng)用于輸尿管狹窄的重建也取得了良好效果。Arai等[20]應(yīng)用羊膜修復(fù)口腔黏膜能很好地與裸露的結(jié)締和肌肉組織結(jié)合，減少出血，促進(jìn)口腔黏膜的再生。

四、羊膜與再生醫(yī)學(xué)

羊膜來源細(xì)胞具有多向分化潛能、低免疫原性、非致瘤性等，能分泌和成多種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞工程中具有很大的應(yīng)用前景。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，羊膜來源細(xì)胞移植治療心肌梗死、肝臟疾病、糖尿病、軟骨疾病、帕金森病等疾病均取得了理想效果[ 6～12 ]。羊膜作為天然無毒的高分子材料，組織相容性好，易于細(xì)胞黏附，來源廣泛，易于塑型等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的生物載體和支架材料?？蓱?yīng)用于構(gòu)建組織工程皮膚、血管、角膜、神經(jīng)等，具有很大的應(yīng)用前景[3]。

五、羊膜潛在的抗腫瘤價(jià)值

近年來，羊膜的抗腫瘤作用逐漸被人們所關(guān)注。Niknejad等報(bào)道羊膜上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)羊膜能減少腫瘤新生血管的形成，阻止了腫瘤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的供應(yīng)，從而減輕腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。羊膜細(xì)胞表達(dá)的一些白介素如IL-2、IL-4 和IL-3，能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK)的細(xì)胞殺傷活性，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊，限制腫瘤的生長(zhǎng)。Magatti等報(bào)道羊膜間充質(zhì)細(xì)胞能誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，減少癌細(xì)胞的增殖。干細(xì)胞治療為腫瘤的研究治療提供了新的方向和新的靶點(diǎn)。羊膜來源干細(xì)胞具有高速增殖能力，也表達(dá)多能干細(xì)胞特定標(biāo)志物OCT4，在體外具有分化為3種胚層細(xì)胞的潛能。并且具有無致瘤性、低免疫原性、抗感染、來源廣泛、易于分離取材等優(yōu)點(diǎn)，為抗腫瘤提供了新的細(xì)胞源。羊膜來源干細(xì)胞含有某些生物活性物質(zhì)，能改變細(xì)胞生長(zhǎng)周期，從而能消弱腫瘤的生長(zhǎng)。在Mencucci等的研究中，應(yīng)用抗病毒藥處理過的羊膜在體外可以抑制病毒的復(fù)制，表明羊膜具有吸收抗病毒藥物和維持藥物釋放的能力。這項(xiàng)研究為控制藥物的釋放開辟了新的途徑，藥物溶浸后的羊膜可能在治療其他疾病方面發(fā)揮重要作用，在腫瘤治療上也值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，羊膜作為天然的生物材料來源廣泛、易于取材，含有多種生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性、抑制新生血管形成、促進(jìn)上皮再生、非致瘤性等特性，羊膜細(xì)胞具有多向分化潛能，能分化成肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨及成骨細(xì)胞、胰島β細(xì)胞等。在眼表重建、皮膚損傷修復(fù)、組織工程等方面有很大的應(yīng)用價(jià)值，在抗腫瘤方面仍需進(jìn)一步探究。

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(修回日期：2015-02-29)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81041082)；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011M501059)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科

張相彤，教授，電子信箱：zgxgtg@sina.com

R318

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.050

2015-01-20)