崔國峰武軍龍 畢鄭剛李福春**

（1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，哈爾濱150001；2.鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院骨科，河南洛陽471009）

·基礎研究·

肉桂鞣質B-1對脊髓星形膠質細胞增殖的調節(jié)作用及對血清氧葡萄糖缺乏/復氧誘導細胞凋亡的保護作用*

崔國峰1武軍龍2△畢鄭剛1李福春1**

（1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，哈爾濱150001；2.鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院骨科，河南洛陽471009）

背景：中樞神經系統(tǒng)中星形膠質細胞對神經元起重要的保護作用。據(jù)報道，一些抗氧化劑可以保護缺血/再灌注引起的星形膠質細胞功能障礙。肉桂鞣質B-1（Cinnam tannin B-1）是一種天然存在的A型原花青素，具有抗氧化作用。

目的：研究肉桂鞣質B-1對脊髓星形膠質細胞的作用。

方法：星形膠質細胞血清氧葡萄糖缺乏（OGSD）8 h后用或不用肉桂鞣質B-1進行復氧（R）。

結果：肉桂鞣質B-1對OGSD/R誘導的星形膠質細胞凋亡具有保護作用，同時具有促進星形膠質細胞增殖的作用，而細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制劑逆轉這種作用。

結論：肉桂鞣質B-1通過ERK信號通路促進星形膠質細胞增殖，保護OGSD/R誘導的細胞凋亡。在中樞神經系統(tǒng)，肉桂鞣質B-1作為一種抗氧化劑對星形膠質細胞缺血/再灌注損傷具有保護作用。

星形膠質細胞；肉桂鞣質B-1；缺血/再灌注；細胞凋亡

Background:ound:Astrocytes are important for protecting neurons in central nervoussystem.Ithas been reported thatsomeantioxidants could protect astrocytes from ischemia-reperfusion-induced dysfunction.Cinnam tannin B-1 is a naturally occurring type-A proanthocyanidin thatexhibitsantioxidantproperties.

Objective:tive:The purposeof the study is to investigate theeffectsof cinnamtannin B-1 on spinal cord astrocytes.

Methods:hods:Astrocyteswere subjected to oxygen-glucose-serum deprivation for eight hours followed by reoxygenation w ith orw ithout cinnam tannin B-1.

Results:ults:Cinnam tannin B-1 protected astrocytes from oxygen-glucose-serum deprivation and reoxygenation-induced apoptosis.Concurrently,cinnam tannin B-1 promoted the proliferation of astrocytesw hereas the extracellular regulated protein kinase(ERK)inhibitor reversed thiseffect.

Conclusions:ions:Cinnamtannin B-1 protectsastrocytes from oxygen-glucose-serum deprivation/reoxygenation-induced apoptosis by promoting astrocyte proliferation via an ERK pathway.Therefore,as an antioxidant,cinnamtannin B-1may provide extra benefit for astrocyte protection during ischem ia-reperfusion in the centralnervous system.

眾所周知，中樞神經系統(tǒng)（central nervous system,CNS）中脊髓缺血將導致嚴重的并發(fā)癥。在一些脊髓缺血的動物模型中可以觀察到嚴重的功能障礙和殘疾，如暫時的傳導減慢或永久性的截癱[1-3]。然而，缺血及隨后再灌注損傷所引起的脊髓神經細胞凋亡機制仍不清楚。

星形膠質細胞是哺乳動物CNS的一類神經膠質細胞，是大腦中數(shù)量最多的神經細胞。有研究顯示，

星形膠質細胞對脊髓損傷有一定的保護作用[4,5]。星形膠質細胞在促進新陳代謝、遞質攝取及其他應激時保護神經元。因此，在缺血/再灌注損傷過程中，星形膠質細胞功能障礙將導致神經細胞凋亡[5-7]。研究證實，在缺血/再灌注損傷過程中，線粒體氧化應激可導致細胞病變甚至死亡[8]。作為CNS中最活躍的星形膠質細胞也參與了這一過程。

肉桂是一種香料，可以作為一種有效的抗氧化劑，有利于2型糖尿病和代謝綜合癥的治療[9,10]。肉桂中含有大量原花青素，即天然存在的類黃酮[11]。此外，已從肉桂的樹皮中初步分離出A型原花青素肉桂鞣質B-1（Cinnam tannin B-1），其由三個單體組成并通過C2→O→7乙醚鍵和碳鍵形成的雙鏈連接（圖1）。體內外試驗研究表明，肉桂鞣質B-1具有很強的抗氧化活性[12,13]，對2型糖尿病有積極的治療作用，而對CNS缺血/再灌注損傷有無保護作用，目前尚無相關報道證實。

圖1 肉桂鞣質B-1的結構

本研究探討肉桂鞣質B-1對原代培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質細胞在血清氧葡萄糖缺乏/復氧（oxygenglucose-serum deprivation/restoration,OGSD/R）時引起的功能障礙是否有保護作用，及其是否通過有絲分裂原活化蛋白激酶（m itogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路以調控細胞增殖，從而保護OGSD誘導的星形膠質細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 試劑

細胞培養(yǎng)試劑，Dulbecco改良的Eagle細胞培養(yǎng)基（Dulbecco'smodified Eagle'smedium,DMEM），胰蛋白酶，胎牛血清（fetalbovine serum,FBS），青霉素和鏈霉素（美國GIBCO提供）。3.4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），PD98059，煙酸己可堿3.42（美國Sigma-A ldrich提供）。肉桂鞣質B-1（表兒茶素-4β→8 2β→O→7）-表兒茶素-（4α→8）-表兒茶素）提取自月桂樹（瑞士A lexis提供）（圖1）?；钚匝酰╮eactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒（中國碧云天生物技術公司提供）。TUNEL染色試劑盒（美國羅氏公司提供）。EdU染色試劑盒和A lexa Fluor 488-標記的羊抗兔IgG抗體（美國Invitrogen提供）。神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）抗體，三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、熒光粉-ERK、Bcl-2和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3抗體（美國圣克魯斯生物技術公司提供）。過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（美國Jackson Immuno Research提供）。

1.2 細胞培養(yǎng)

采用原代脊髓星形膠質細胞進行培養(yǎng)[14]。使用新生Sprague-Daw ley大鼠（出生后1 d），仔細解剖脊髓，使其與腦脊膜分離。37℃胰蛋白酶（0.25%）分解脊髓5m in，將懸浮液在1500 rpm下離心5m in，去除上清液后用200μm網(wǎng)篩過濾細胞，將細胞接種在含有10%FBS、100 IU/m l青霉素和100μg/m l鏈霉素的6孔板上，在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)14 d后進行本研究。去除培養(yǎng)基，PBS液沖洗后進行OGSD。細胞暴露于含有95%N2和5%CO2的缺氧氣室，在無血清和葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，然后將培養(yǎng)基從氣室中取出，加入葡萄糖和FBS并將細胞置于正常條件下以不同的時間進行復氧[15]。

1.3 MTT MTT法測定生成的ROS ROS

將星形膠質細胞種植于96孔板中（每孔15000個細胞），復氧4 h以上添加MTT試劑（0.5mg/m l），然后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）溶解不溶性紫色甲臜產物。通過MK3酶標儀（上海賽默飛世爾科技有限公司提供）測定一定波長（490 nm）的吸光度。通過ROS檢測試劑盒檢測各組細胞ROS的產生情況。ROS存在時，2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）可轉換為熒光二氯熒光素（DCF），在488 nm的激發(fā)波長及535 nm的發(fā)射波長時，通過Flexstation 3檢測15000個細胞/孔的DCF熒光分布情況。

1.4 免疫熒光

將原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質細胞與星形膠質細胞標記物GFAP進行染色。以每孔500000個細胞種植于6孔玻璃板上，并用4%多聚甲醛過夜固定進行免疫熒光。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗細胞3次，之后用1%牛血清白蛋白（BSA）在室溫下阻斷15m in。在玻璃板上加入兔抗-GFAP單克隆初級抗體（1:100

稀釋）并在4℃下過夜培養(yǎng)。經過多次PBS沖洗后，將細胞用A lexa Fluor 488標記的羊抗兔IgG抗體在室溫下黑暗中培養(yǎng)2 h。PBS沖洗后，用煙酸己可堿3.42染色細胞核。在EdU染色中，EdU試劑盒在細胞植入玻璃板前應用。通過顯微鏡（DP70，日本Olympus公司提供）采集圖片。

1.5 TUNEL TUNEL染色

細胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，經處理后，凋亡細胞用TUNEL試劑盒進行染色。凋亡細胞用綠色熒光進行標記，總細胞數(shù)用煙酸己可堿3.42染色。

1.6 免疫印跡（Western Blot n Blot）分析

經處理后，細胞用RIPA溶解液進行溶解。應用改良的免疫印跡進行分析[16]。分別稀釋初級抗體如下：熒光性ERK（1:1000）、ERK（1:1000）、bcl-2（1: 500）、caspase-3(1:500)、GAPDH（1:5000）。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，進行單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。細胞凋亡率按照凋亡細胞除以總細胞數(shù)進行計算。

2 結果

2..11原代培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質細胞

在中樞神經系統(tǒng)內，星形膠質細胞特異性表達GFAP[17]。因此，可鑒定出原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質細胞的純度，在原代培養(yǎng)的細胞中可以用免疫細胞化學顯示GFAP陽性的星形膠質細胞。培養(yǎng)14 d后，超過95%的細胞出現(xiàn)GFAP抗體染色陽性和煙酸己可堿3.42（Hoechst3.42）染色陽性（圖2）。

2.2 肉桂鞣質B-B-11通過ERK/Bcl-/Bcl-22通路保護OGSD/R GSD/R誘導的星形膠質細胞凋亡

據(jù)報道，OGSD/R抑制星形膠質細胞的生存能力[18]。MTT法觀察不同組別肉桂鞣質B-1對OGSD/R誘導的星形膠質細胞生存能力的保護作用，與未進行復氧組相比，OGSD 8 h后復氧，星形膠質細胞的生存能力均顯著下降，而OGSD 24、48、72 h后復氧的結果之間無明顯差異（圖3）。與此相反，OGSD/R聯(lián)合肉桂鞣質B-1處理組的細胞生存能力顯著高于單純OGSD/R處理組（圖3）。此外，不同濃度的肉桂鞣質B-1對星形膠質細胞的存活能力或細胞凋亡無影響。

圖3 MTT法測定肉桂鞣質B-1對星形膠質細胞生存能力的影響

在OGSD/R過程中產生的ROS導致氧化應激和細胞凋亡[19]。OGSD 8 h/復氧24 h后能夠檢測到產生的ROS，OGSD/R顯著提高細胞內ROS的水平（圖4），與單純OGSD/R處理組相比，10μM肉桂鞣質B-1聯(lián)合OGSD/R處理組細胞的ROS被顯著抑制（圖4），即肉桂鞣質B-1減少缺血/再灌注過程中ROS的生成。

由于肉桂鞣質B-1在OGSD時保護星形膠質細胞和減少ROS的產生，使用TUNEL染色法觀察肉桂鞣質B-1聯(lián)合OGSD 8 h/復氧24 h處理組與單純OGSD 8 h/復氧24 h處理組星形膠質細胞的凋亡率。雖然與單純OGSD/R處理組相比，聯(lián)合1μM肉桂鞣質B-1處理組無明顯變化，但聯(lián)合10μM肉桂鞣質B-1處理組在OGSD/R時凋亡細胞的數(shù)量減少（圖5）。

圖2 原代星形膠質細胞培養(yǎng)14 d

圖4 DCF熒光法測定肉桂鞣質B-1在ROS產生過程中的作用

在細胞凋亡過程中，特別是缺血/再灌注誘導的細胞死亡，線粒體氧化應激起重要作用[19,20]。為了識別在OFSD/R時，肉桂鞣質B-1是否通過減少線粒體凋亡保護星形膠質細胞，需要免疫印跡法分析一些參與線粒體氧化應激誘導細胞凋亡的蛋白質表達水平。如圖6所示，細胞經OGSD 8 h/復氧24 h后，p-EPK和Bcl-2的表達減少，caspase-3的表達增加。經肉桂鞣質B-1處理的細胞內p-EPK和Bcl-2的表達高于單純OGSD/R組。同時，肉桂鞣質B-1以劑量依賴的方式抑制caspase-3的激活。綜上所述，肉桂鞣質B-1可能通過增加EPK的磷酸化及Bcl-2的表達來保護原代培養(yǎng)的星形膠質細胞免受OGSD/R誘導的細胞凋亡。

2.3 肉桂鞣質B-B-11通過EPK EPK途徑調節(jié)脊髓星形膠質細胞的增殖

圖6 免疫印跡法分析參與線粒體氧化應激誘導細胞凋亡的蛋白質表達水平

在OGSD/R條件下，經肉桂鞣質B-1處理的細胞內EPK磷酸化水平升高。EPK磷酸化在MAPK通路中起著重要的作用，這與細胞增殖有關[21]。因此，肉桂鞣質B-1可能影響星形膠質細胞的增殖。如圖7所示，10μM的肉桂鞣質B-1顯著改善星形膠質細胞的增殖。同時，MAPK抑制劑PD98059可逆轉這種作用。此外，EdU試劑盒測定星形膠質細胞的增值率。在EdU測定過程中，增殖的細胞核可被標記為熒光探針[22]。根據(jù)MTT法的檢測結果，10μM的肉桂鞣質B-1刺激星形膠質細胞的增殖。然而，PD98059抑制這種作用。綜上所述，肉桂鞣質B-1至少部分通過激活ERK調節(jié)脊髓星形膠質細胞的增殖。

3 討論

肉桂的主要成分原花青素具有抗氧化活性[23]。從肉桂和其他一些植物中分離出的肉桂鞣質B-1是天然存在的原花青素[24]。研究證實，在許多類型細胞中，肉桂鞣質B-1作為一種有效的抗氧化劑，有三個黃烷-3-醇亞單位以及其對抗ROS的保護作用[24-27]。據(jù)報道，肉桂鞣質B-1所具有的抗氧化性可用于2型糖尿病的治療并取得了一定的效果[28]。然而，肉桂鞣質B-1對缺血/再灌注誘導的細胞凋亡的作用尚無相

關研究。本研究發(fā)現(xiàn)肉桂鞣質B-1對OGSD/R誘導的原代培養(yǎng)的星形膠質細胞損傷具有保護作用。

圖5 TUNEL染色法觀察肉桂鞣質B-1對星形膠質細胞凋亡率的影響

圖7 MTT法檢測肉桂鞣質B-1對星形膠質細胞增殖的調節(jié)作用

氧化應激在細胞死亡過程中起重要作用且參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如缺血/再灌注損傷和某些神經退行性病變[8,29]。在這個過程中，生成的ROS導致細胞損傷。線粒體細胞內產生的ROS主要抑制呼吸鏈的組成部分[30]，促進細胞色素C的釋放和激活凋亡誘導因子（AIF）[31,32]。脊髓細胞內ROS增加以及ROS介導的細胞凋亡已經被報道[33]。同時我們發(fā)現(xiàn)經OGSD/R處理的原代培養(yǎng)星形膠質細胞產生的ROS顯著高于未進行復氧組，抗氧化劑和肉桂鞣質B-1減少經OGSD/R處理的原代培養(yǎng)星形膠質細胞產生ROS，因此，肉桂鞣質B-1在保護細胞存活方面可作為一個考慮因素。

研究證實，MAPK通路與細胞增殖和凋亡過程密切相關[34,35]。星形膠質細胞中產生的ROS參與激活ERKA[36]。然而，ROS的不均衡性產生可導致嚴重的自由基損傷。此外，線粒體膜表面上大量的促凋亡和抗凋亡蛋白也參與這個過程。自由基誘導細胞色素C激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3導致細胞死亡[37]。同時，抗凋亡蛋白Bcl-2通過抑制氧自由基引起的膜損傷從而防止細胞凋亡[38,39]。本研究確定了OGSD/R處理后，存在/不存在肉桂鞣質B-1時細胞的凋亡率，并且發(fā)現(xiàn)肉桂鞣質B-1對OGSD/R誘導的細胞凋亡具有保護作用。減少ROS的產生以及恢復ERK的活性可能也參與其中，導致Bcl-2的表達增加和caspase-3的活性降低。

星形膠質細胞通過激活某些內源性抗氧化劑如谷胱甘肽（GSH）調節(jié)ROS，從而維持神經元的存活[40,41]。星形膠質細胞抗氧化功能缺失可導致神經元損傷[42,43]。發(fā)生在脊髓的某些疾病如脊髓肌肉萎縮癥（SMA）和肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）與星形膠質細胞的功能喪失有關[44]。因此，使用外源性抗氧化劑有利于保護中樞神經系統(tǒng)。

本研究發(fā)現(xiàn)OGSD/R誘導的細胞凋亡過程中，經肉桂鞣質B-1處理的細胞ERK磷酸化的水平升高。因此推測肉桂鞣質B-1對正常培養(yǎng)的星形膠質細胞有影響。與正常培養(yǎng)的星形膠質細胞相比，10μM肉桂鞣質B-1顯著提高細胞的存活率，而ERK磷酸化抑制劑PD98059可逆轉這種作用。此外，EdU染色結果顯示，肉桂鞣質B-1具有促進星形膠質細胞增殖的作用，而PD98059則阻斷這種作用。綜上所述，肉桂鞣質B-1通過MAPK通路，至少是通過ERK磷酸化作用于星形膠質細胞。

綜上，在OGSD/R誘導的細胞凋亡過程中，肉桂鞣質B-1通過調節(jié)ROS的產生保護星形膠質細胞，并且通過MAPK通路促進細胞增殖。肉桂鞣質B-1對缺血/再灌注有關的疾病具有一定的治療作用。

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Cinnam tannin B-nin B-11 regulates cellproliferation of spinal cord l cord astrocytesand protects the cells from oxygen-glucose-serum deprivation/reoxygenation-induced apoptosis*

CUIGuofeng1,WU Junlong2△,BIZhenggang1,LIFuchun1**
(1.Departmentof Orthopaedics,the FirstAffiliated Hospital,Harbin MedicalUniversity,Harbin 150001;
2.Departmentof Orthopedics,Luoyang CentralHospital,Zhengzhou University,Luoyang 471009,Henan,China)

ords:Astrocytes;Cinnam tannin B-1;Ischem ia-reperfusion;Apoptosis

2095-9958（2015）02-0 071-07

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.01-014

黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題（2014-272）；2015哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院科研基金

**通信作者：李福春，E-mail:lfcmxl@163.com△共同第一作者