高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定家蠶血液中β－蛻皮激素

唐博志，李 龍，武國(guó)華，

（1．江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑產(chǎn)品及食用昆蟲質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018）

高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定家蠶血液中β－蛻皮激素

唐博志1，李 龍2，武國(guó)華1，2

（1．江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑產(chǎn)品及食用昆蟲質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018）

建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）測(cè)定家蠶血液中β－蛻皮激素的方法。實(shí)驗(yàn)以高油菜素內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，用乙腈去除家蠶血液樣品中的蛋白質(zhì)；C18反相柱作為分析色譜柱，以乙腈和含0．5％乙酸的水溶液作為流動(dòng)相，使用梯度洗脫的方法進(jìn)行液相色譜分離。在優(yōu)化的儀器條件下，血液中蛻皮激素的加標(biāo)回收率在83．56％～97．11％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5．4％，在3．13～50μg／L濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2為0．996 3，方法的檢出限為0．2μg／L。該方法能較好地滿足測(cè)定家蠶血液中β－蛻皮激素含量的要求，同時(shí)也可被推廣測(cè)定其他昆蟲血液中的β－蛻皮激素。

β－蛻皮激素；家蠶；血液；高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）

β－蛻皮激素又叫20－羥基蛻皮酮，簡(jiǎn)稱20E，是一種能促進(jìn)甲殼動(dòng)物蛻皮的激素，分子式為C27H44O7，結(jié)構(gòu)式示于圖1。它具有調(diào)控甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的作用，廣泛存在于昆蟲、蟹等動(dòng)物體內(nèi)［1－2］。此外，蛻皮激素還存在于植物中，某些植物的蛻皮激素含量遠(yuǎn)高于動(dòng)物，是提取蛻皮激素的主要來(lái)源［3］。目前，蛻皮激素主要應(yīng)用于家蠶、蝦蟹等甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中，用于調(diào)節(jié)甲殼動(dòng)物的新陳代謝，使甲殼動(dòng)物快速而順利地完成蛻皮，促進(jìn)其生長(zhǎng)［4］。近年來(lái)，對(duì)蛻皮激素的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素具有促進(jìn)人體肝臟蛋白質(zhì)的合成和脂肪代謝，以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖等作用［5］。

圖1 β－蛻皮激素的結(jié)構(gòu)式Fig．1 Structure of 20－h(huán)ydroxyecdysone

蛻皮激素的定量分析方法主要有分光光度法［6］、高效毛細(xì)管電泳法［1］、薄層掃描法［7］，放射免疫測(cè)定法［8］、液相色譜法［3，9－11］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［12－14］等。其中，高效毛細(xì)管電泳法和薄層掃描法的靈敏度低，使用較少；放射免疫測(cè)定法可以達(dá)到更低的定量限，但因受到放射性污染等實(shí)驗(yàn)條件的限制也較少使用；高效液相色譜法的定量分析效果較好，但是檢出限高于1mg／L［3，9－11］，目前主要用于分析植物樣品或者蛻皮激素含量較高的動(dòng)物樣品。盡管液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法因其抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)在定量分析中有著較廣泛的應(yīng)用，但對(duì)昆蟲體內(nèi)痕量蛻皮激素研究的例子很少［12－14］，且尚未見用于家蠶血液中蛻皮激素定量分析的報(bào)道。

本研究擬建立高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）法測(cè)定家蠶血液中蛻皮激素，旨在為進(jìn)一步研究蛻皮激素含量在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化規(guī)律以及產(chǎn)生的影響提供有價(jià)值的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo－Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 2．1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Hypersil Gold C18（50mm× 2．1mm×1．9μm）色譜柱、Hypersil Gold C18（10mm×2．1mm×3μm）保護(hù)柱：美國(guó)Thermo－Fisher公司產(chǎn)品；R－3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；Mili－Q超純水系統(tǒng)：法國(guó)Milipore公司產(chǎn)品。

供試的家蠶品種為C108：由中國(guó)農(nóng)科院蠶業(yè)研究所提供；β－蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98％）：上海純優(yōu)生物科技公司產(chǎn)品；高油菜素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度98％）：上海一基實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；苯基硫脲（分析純），甲酸（色譜純）：上海晶純實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇（色譜純）：Burdick ＆Jackson公司產(chǎn)品；水：由Mili－Q超純水系統(tǒng)制備。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取5．0mgβ－蛻皮激素，用甲醇溶解，配制成500mg／L儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中避光保存。

1．2 儀器條件

1．2．1 色譜條件 流動(dòng)相：A為含0．5％乙酸

的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4min、15％B，4～7min、15～100％B，7～10min、100％B，10～12min、100～15％B，12～16min、15％B；流速200μL／min；進(jìn)樣量10μL；分析時(shí)間16min。

1．2．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式，噴霧電壓5 000V，鞘氣流速12L／min，輔助氣流速1．5L／min，加熱氣溫度242℃，離子傳輸管溫度204℃。碰撞氣（Ar）壓力0．21Pa，碰撞能量12eV。在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式下，選擇m／z481．2作為蛻皮激素的母離子，m／z 445．3作為子離子進(jìn)行定量分析；選擇m／z495．5作為內(nèi)標(biāo)高油菜素內(nèi)酯的母離子，m／z459．5作為子離子進(jìn)行定量分析；掃描時(shí)間0．1s。

1．3 樣品前處理

家蠶C108飼養(yǎng)到4齡第1天開始取樣，剪破腹足取血，向血液中加入苯基硫脲抗氧化劑，置于－20℃冰箱中保存。樣品包括4齡第1天到第5天的家蠶血液，以及5齡第1天到第7天的血液。每份血液樣品取3份平行試樣。

家蠶血液超聲20min后，取0．4mL血液于2mL離心管中，加入1．6mL乙腈，渦旋混合30s后，以12 000r／min離心8min。將2份離心后的上清液（共約4mL）合并至10mL梨形瓶中，加入0．1mL 2mg／L高油菜素內(nèi)酯，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入1mL純水復(fù)溶，離心，再用0．22μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2．1 質(zhì)譜和色譜分離條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式，對(duì)1mg／L蛻皮激素和高油菜素內(nèi)酯進(jìn)行質(zhì)譜分析。在正離子模式下，蛻皮激素主要產(chǎn)生3種正離子：m／z481．2（［M＋H］＋），m／z 503．4（［M＋Na］＋）和m／z 519．3（［M＋K］＋），示于圖2a；內(nèi)標(biāo)高油菜素內(nèi)酯主要產(chǎn)生3種正離子：m／z 495．5（［M＋H］＋），m／z517．1（［M＋Na］＋）和m／z533．2（［M＋K］＋），示于圖2b。由于蛻皮激素中m／z481．2和高油菜素內(nèi)酯中m／z495．5強(qiáng)度最高，因此選擇m／z 481．2和m／z 495．5分別作為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下蛻皮激素和高油菜素內(nèi)酯的母離子。對(duì)m／z481．2（［M＋H］＋）進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，其主要碎片離子為m／z 371．0、m／z 445．3和m／z 165．1，示于圖3a。由于碎片離子m／z 445．3（由母離子m／z 481．2脫去2個(gè)水分子形成）信號(hào)最強(qiáng)，因此選擇m／z445．3作為定量離子對(duì)中的子離子。對(duì)高油菜素內(nèi)酯的m／z 495．5（［M＋H］＋）進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，其主要碎片離子為m／z 459．3、m／z343．1和m／z 109．3，示于圖3b。由于碎片離子m／z 459．3信號(hào)最強(qiáng)（由母離子m／z 495．5脫去2個(gè)水分子形成），故選擇m／z 459．3作為SRM模式中的子離子。

對(duì)蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有加入0．1％乙酸時(shí)，m／z 481．2（［M＋H］＋）強(qiáng)度很低，而且不穩(wěn)定。隨后，選用乙腈加0．1％乙酸和甲醇加0．1％乙酸作為流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈加0．1％乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，質(zhì)譜峰的峰形更平滑、干擾較少、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度也更高。

圖2 正離子模式下，β－蛻皮激素（a）和高油菜素內(nèi)酯（b）的質(zhì)譜圖Fig．2 Mass spectrums of 20－h(huán)ydroxyecdysone（a）and 22（S），23（S）－h(huán)omobrassinolide（b）in positive mode

乙腈加0．1％乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，高油菜素內(nèi)酯的峰型拖尾嚴(yán)重，只有將乙酸濃度提高

到0．5％時(shí)才具有良好的峰型，因此選擇0．5％乙酸加乙腈作為流動(dòng)相。

考慮到本實(shí)驗(yàn)所使用的色譜柱直徑小、填料粒徑小，易被固體顆粒堵塞。因此，配備了保護(hù)柱來(lái)保護(hù)色譜柱。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式總離子流圖示于圖4。

圖3 正離子模式下，β－蛻皮激素（a）和高油菜素內(nèi)酯（b）的子離子全掃質(zhì)譜圖Fig．3 Fragment ion mass spectra of 20－h(huán)ydroxyecdysone（a）and 22（S），23（S）－h(huán)omobrassinolide（b）in positive mode

圖4 12．5μg／L蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式總離子流圖Fig．4 Selected reaction monitoring chromatograms of 12．5μg／L standard 20－h(huán)ydroxyecdysone（a）and sample（b）

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和檢出限

分別配制3．13、6．25、12．50、25、50μg／L蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，向每份標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入高油菜素內(nèi)酯，使其含量為200μg／L，用LC－MS／MS分析。在3．13～50μg／L范圍內(nèi)，β－蛻皮激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖5，線性方程為y＝0．219 8x－0．474 8，相關(guān)系數(shù)（R2）為0．996 3。最低濃度點(diǎn)3．13μg／L和空白樣品的總離子流圖示于圖6。由圖6可見，最低濃度點(diǎn)時(shí)，峰形已變得較差，同時(shí)空白樣品也存在一定的干擾。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這一線性范圍適合大部分待測(cè)的家蠶血液樣品，只有4齡第4天和第5天的家蠶血液樣品中蛻皮激素含量高于50μg／L，因此，用純水將4齡第4天血液稀釋5倍，4齡第5天血液稀釋10倍后，再進(jìn)行樣品前處理和質(zhì)譜檢測(cè)分析。

圖5 β－蛻皮激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．5 Standard curve of 20－h(huán)ydroxyecdysone

用10μL 0．4μg／L蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)得信噪比S／N＝8，按信噪比S／N＝3計(jì)算得到的蛻皮激素檢出限為0．2μg／L。

2．3 樣品前處理及回收率和精密度

家蠶血液，又稱血淋巴，是家蠶血漿與淋巴

液的混合物。與哺乳動(dòng)物全血相比，家蠶血液樣品中的有機(jī)物或干擾離子較少，用乙腈去蛋白后便可直接上機(jī)分析。為了保證較高的回收率和平行性，采用超聲法對(duì)血液中的細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。用乙腈去蛋白后的樣品中乙腈含量過(guò)高，導(dǎo)致色譜峰形較差，可通過(guò)將樣品蒸干、純水復(fù)溶的前處理方法，消除乙腈對(duì)色譜分離的影響。

圖6 3．13μg／L蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品（a）和空白樣品（b）的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式總離子流圖Fig．6 Selected reaction monitoring chromatogram of 3．13μg／L standard 20－h(huán)ydroxyecdysone（a）and blank sample（b）

將5齡第6天的家蠶C108血液超聲提取20min，取0．4mL血液于2mL離心管中，加入1．6mL乙腈，渦旋混合30s后，以12 000r／min離心3min。

低濃度組：將1份離心后的上清液（約2mL）移入梨形燒瓶中，加入0．1mL 2mg／L高油菜素內(nèi)酯，再分別加入0．1mL 50、60和70μg／L標(biāo)準(zhǔn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入1mL純水復(fù)溶，用0．22μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

中濃度組：將2份離心后的上清液（約4mL）移入梨形燒瓶中，加入0．1mL 2mg／L高油菜素內(nèi)酯，然后分別加入0．1mL 100、120和140μg／L標(biāo)準(zhǔn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入1mL純水復(fù)溶，用0．22μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

高濃度組：將3份離心后的上清液（約6mL）移入梨形燒瓶中，加入0．1mL 2mg／L高油菜素內(nèi)酯，再分別加入0．1mL 150、180和210μg／L標(biāo)準(zhǔn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入1mL純水復(fù)溶，用0．22μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

每種濃度的樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，每次平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算方法的回收率和精密度，結(jié)果列于表1。由表1可見，由于受離子干擾等因素的影響，方法的精密度較差。

表1 β－蛻皮激素的加標(biāo)回收率（n＝5）Table 1 Recoveries of 20－Hydroxyecdysone

2．4 家蠶不同生長(zhǎng)時(shí)期蛻皮激素含量的變化

使用上述方法定量測(cè)定了4齡第1天至第5天、5齡第1天至第7天家蠶血液中蛻皮激素的含量，檢測(cè)結(jié)果示于圖7。

圖7 家蠶不同生長(zhǎng)時(shí)期蛻皮激素的含量Fig．7 Contents of 20－h(huán)ydroxyecdysone in silkworms’hemolymph in different instars

由圖7可以看出，家蠶4齡第1天到第5天，血液中的蛻皮激素含量從檢測(cè)不出遞增到239．3μg／L，表明家蠶從4齡第2天便開始分泌蛻皮激素，為4齡蛻皮做準(zhǔn)備。家蠶4齡第5天到5齡第1天，血液中蛻皮激素含量迅速下降，表明家蠶蛻皮后，其血液中的蛻皮激素含量迅速減少。從5齡第4天到第7天，家蠶血液中蛻皮激素含量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，表明家蠶分泌蛻皮激素為結(jié)繭和蛻皮等做準(zhǔn)備，但有趣的是，結(jié)繭前家蠶血液中蛻皮激素含量遠(yuǎn)低于4齡最后一天。4齡和5齡家蠶血液中蛻皮激素含量的變化規(guī)律表明，蛻皮激素對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。羅堅(jiān)等［15］、趙凌藝等［16］在研究添食蛻皮激素對(duì)5齡家蠶的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)早地添食蛻皮激素雖然可以使家蠶提前成熟，但會(huì)影響家蠶的產(chǎn)繭量和繭質(zhì)；而5％家蠶在見熟的時(shí)候添喂蛻皮激素對(duì)蠶繭產(chǎn)量和繭質(zhì)沒(méi)有明顯影響，且便于集中上蔟。他們的實(shí)驗(yàn)表明，在5齡第5天前給家蠶添食蛻皮激素雖然可以提高家蠶血液中蛻皮激素的含量，加速家蠶的生長(zhǎng)，使家蠶提前成熟，但同時(shí)也影響了蠶繭的產(chǎn)量和繭質(zhì)，由于存在個(gè)體差異，可能導(dǎo)致家蠶上簇不齊；如果在5齡第7天、第8天給家蠶添食蛻皮激素，可加速其生長(zhǎng)，便于集中上蔟，對(duì)蠶繭生產(chǎn)是有幫助的。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定家蠶血液中蛻皮激素的含量。以高油菜素內(nèi)酯作為內(nèi)標(biāo)，用乙腈去除家蠶血液中蛋白質(zhì)，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)及色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，檢出限為0．2μg／L，線性范圍為3．13～50μg／L，相關(guān)系數(shù)R2為0．996 3，加標(biāo)回收率為83．56％～97．11％。采用該方法檢測(cè)4齡和5齡家蠶血液中蛻皮激素的含量，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前，家蠶血液中蛻皮激素含量逐漸升高，蛻皮后，血液中蛻皮激素含量迅速下降。該方法可為研究蛻皮激素對(duì)家蠶生理和生化影響提供一種高靈敏的分析手段，為家蠶育種提供直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Determination of 20－Hydroxyecdysone in Hemolymph of Bombyx mori by HPLC－MS／MS

TANG Bo－zhi1，LI Long2，WU Guo－h(huán)ua1，2
（1．School of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang212018，China；2．Laboratory of Quality ＆Safety Risk Assessment for Sericultural Products and Edible Insects，Ministry of Agriculture，Sericultural Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang212018，China）

A method for the determination of 20－h(huán)ydroxyecdysone in hemolymph of Bombyx mori was developed by high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（HPLC－MS／MS）．22（S），23（S）－h(huán)omobrassinolide was used as an internal standard，and acetonitrile was used to precipitate the proteins in the hemolymph of Bombyx mori to eliminate the interference．The gradient elution program was performed on a C18column using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0．5％acetic acid solution．Under the optimum working conditions of the instrument，the analytical results show that the recoveries of 20－h(huán)ydroxyecdysone in hemolymph of Bombyx mori

20－h(huán)ydroxyecdysone；Bombyx mori；hemolymph；high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（HPLC－MS／MS）

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0052－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0057

2014－02－20；

2014－05－30

“十二五”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS－18）；江蘇特聘教授科研基金（16112000625）資助

唐博志（1987—），男（漢族），廣東湛江人，碩士研究生，應(yīng)用化學(xué)專業(yè)。E－mail：tang．brody＠gmail．com

武國(guó)華（1963—），男（漢族），安徽人，研究員，從事質(zhì)譜在生物學(xué)中的應(yīng)用研究。E－mail：georgew511＠hotmail．co．uk

時(shí)間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0057．html

are in the range of 83．56％－97．11％，and the relative standard deviation is below 5．4％．Linearity of the method in the range 3．13－50μg／L is good with the correlation coefficients（R2）of 0．996 3．The detection limit of the method is 0．2μg／L．The method can meet the need for the determination of 20－h(huán)ydroxyecdysone in the hemolymph of Bombyx mori，which may also be applied to determine 20－h(huán)ydroxyecdysone in the hemolymph of other insects．