許澤輝羅世強(qiáng)王敬仁蔡鵬飛覃肖唐寧★

·論著·

柳州市2014年手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析

許澤輝1，2羅世強(qiáng)1，2王敬仁1，2蔡鵬飛1，2覃肖1，2唐寧1，2★

目的明確柳州地區(qū)手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）病毒的主要感染病毒型別及流行特征，為手足口病防治提供科學(xué)依據(jù)。方法收集2014年1月至2014年12月6 667例疑似手足口病感染者。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法，對(duì)腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇腸道病毒16型（coxsackievirus A16，CoxA l6）特異性進(jìn)行核酸檢測(cè)。結(jié)果6 667例患者標(biāo)本中，EV71陽性數(shù)為1 310例，陽性率為19.65％，CoxA16陽性數(shù)為858例，陽性率12.87％。EV71和CoxA16合并感染陽性數(shù)為11例，陽性率為0.16％。男性人群手足口病發(fā)病率高于女性，4月～9月份為發(fā)病高峰。結(jié)論柳州市2014年手足口病主要致病病毒為EV71、CoxA16，基因分型對(duì)手足口病臨床診治及疾病爆發(fā)的預(yù)防有一定指導(dǎo)意義。

手足口病；病毒核酸；流行特征；防控措施

由腸道病毒（enterovirus，EV）引起的手足口?。╤and，footandmouth disease，HFMD）是一種兒童期常見傳染病。該病于5歲以下兒童好發(fā)，大多數(shù)患兒癥狀較輕，表現(xiàn)為低熱、厭食、口痛及手、足、口腔等部位出現(xiàn)小潰瘍或小皰疹。少數(shù)患兒會(huì)出現(xiàn)心肌炎、無菌性腦膜炎、肺水腫等并發(fā)癥。若病情發(fā)展快，可導(dǎo)致個(gè)別重癥患兒死亡。目前為止已有20多種（型）的腸道病毒可引發(fā)手足口病，最為常見的是腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，Cox A16）［1，2］。本文對(duì)2014年采集的共6 667例疑似HFMD感染者的咽拭子、糞便或皰疹液標(biāo)本進(jìn)行了EV核酸檢測(cè)，并結(jié)合病例臨床信息對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

按照《手足口病預(yù)防控制指南（2010年版）》要求，采集柳州市婦幼保健院的6 667例疑似HFMD感染者（即發(fā)熱及手掌、腳掌、股部或口腔黏膜出現(xiàn)皰疹的患者）的咽拭子、糞便、皰疹液標(biāo)本，其中男性3 846例，女性2 821例，年齡5天至14歲，平均年齡（2.30±0.02）歲。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA核酸提取

采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的病毒RNA核酸提取試劑盒進(jìn)行EV核酸提取，嚴(yán)格按照說明書操作，收集病毒RNA提取液30μL，保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EV核酸檢測(cè)

采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的腸道病毒71型核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）進(jìn)行EV17、Cox A16的核酸檢測(cè)，所用儀器為美國ABI公司ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增儀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照其操作說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柳州市兒童手足口病的概況

柳州市手足口病全年的流行趨勢(shì)見表1。EV71在不同季節(jié)流行情況的差異有顯著意義（χ2＝65.33，P＜0.001），其中以春夏兩季最高；Cox A16在不同季節(jié)流行情況的差異有顯著意義（χ2＝335.03，P＜0.001），其中以冬春兩季最高；EV71陽性合并Cox A16陽性的發(fā)病情況無季節(jié)差異。

對(duì)6 667例疑似HFMD感染者標(biāo)本進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示EV71型陽性者1 310例，Cox A16陽性者858例，EV71、Cox A16的陽性率分別為19.65％（1 310／6 667）、12.87％（858／6 667），EV71和Cox A16同時(shí)陽性者11例，陽性率為0.16％，具體結(jié)果見表2。EV71型的陽性檢出率顯著高于Cox A16的檢出率（χ2＝112.53，P＜0.001），部分檢測(cè)結(jié)果見圖1。

2.2 人群分布特征

表1 不同季節(jié)患兒的EV檢出情況Table 1 The detectable rates of the virus subtypes in different seasons

按照不同年齡組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其構(gòu)成

比。按照手足口病病例的年齡（0～、1～、2～、3～、4～、＞5歲）進(jìn)行分組，在EV71病毒感染組中，不同年齡組發(fā)病構(gòu)成由高到低依次為3～（31.71％）、2～（24.33％）、＞5（23.90％）、4～（22.44％）、1～（17.79％）、0～（9.00％），χ2＝220.20，P＜0.001；在Cox A16病毒感染組中，不同年齡組發(fā)病構(gòu)成由高到低依次為4～（18.05％）、2～（13.79％）、3～（13.02％）、＞5（12.91％）、1～（12.47％）、0～（11.05％），χ2＝15.64，P＝0.008。EV71和Cox A16病毒合并感染主要分布在2歲～5歲的兒童中，具體結(jié)果見表2。

圖1 EV71、Cox A16基因分型結(jié)果Figure 1 The genotyping results of EV71 and Cox A16

表2 不同年齡患兒的EV檢出情況Table 2 The detectable rates of the virus subtypes in differentages

2.3 性別分布特征

根據(jù)性別對(duì)不同病原體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。EV71在男女患兒中的陽性率均最高，其次為Cox16，EV71合并Cox A16感染的患兒則比較罕見；在EV71、Cox A16病毒感染及EV71陽性合并Cox A16陽性組中，男性人群的手足口病發(fā)病率與女性之間的差異無顯著意義，說明EV71、Cox A16病毒感染在不同性別的感染情況無差異。

2.4 月份分布特征

2014年手足口病的流行發(fā)病時(shí)間是4月～9月，5月份最高，達(dá)到2 355例；1月、2月、3月、11月和12月發(fā)病人數(shù)在100以下；4月～9月發(fā)病人數(shù)為6 338例，占全年的95.06％（圖2）。

表3 不同性別患兒的EV檢出情況Table 3 The detectable rates of the virus subtypes in differentgenders

圖2 不同月份兒童手足口病發(fā)病人數(shù)趨勢(shì)Figure 2 Prevalent features of HFMD in differentmonths

2.5 重型病例情況分析

2014年備案的重型中，由EV71引起的有68例，其中危重型4例，重型55例，轉(zhuǎn)為危重9例，而Cox A16引起的重型病例一共5例（3例重型，2例轉(zhuǎn)為危重）。EV71病毒感染導(dǎo)致危重型、重型及轉(zhuǎn)為危重型病之和與Cox A16病毒感染導(dǎo)致危重型、重型及轉(zhuǎn)為危重型病之和存在著明顯的差異（P＜0.05），且EV71病毒感染更容易導(dǎo)致重型手足口病，結(jié)果見表4。

表4 EV71與CoxA16病毒感染所導(dǎo)致的重型病例分布情況Table 4 Severe HFMD caused by EV71 and CoxA16

3 討論

手足口病一般由多種腸道病毒共同引起，其中以Cox A16、EV71為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，部分病例臨床表現(xiàn)不典型，患兒就診時(shí)間早，早期只表現(xiàn)為發(fā)熱，無皮疹及其他表現(xiàn)，給早期診斷帶來困難，易導(dǎo)致誤診，是引起危重手足口發(fā)生的重要原因之一［3］。因此對(duì)于流行季節(jié)的嬰幼兒，雖無手足口病的典型表現(xiàn)也要高度懷疑，做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室診斷，而采用簡便、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)則是實(shí)驗(yàn)室診斷的關(guān)鍵［4］。

RT-qPCR是將PCR技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸的自動(dòng)化檢測(cè)的技術(shù)，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用PCR對(duì)DNA的高效擴(kuò)增，運(yùn)用高特異性的探針和高敏感性的光譜技術(shù)檢測(cè)目的片段及定量。RT-qPCR對(duì)病毒的檢測(cè)極大地縮短了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問題，可以盡早發(fā)現(xiàn)病毒攜帶者，為疾病的預(yù)防及診治提供科學(xué)依據(jù)。因此熒光定量基因檢測(cè)方法可準(zhǔn)確、靈敏地反映EV感染數(shù)量和治療恢復(fù)情況，對(duì)EV診斷和療效的觀察具有重要的指導(dǎo)作用［5－8］。

本研究6 667例患者標(biāo)本中，檢測(cè)出EV71陽性數(shù)為1 310例，陽性率為19.65％；CoxA16陽性數(shù)為858例，陽性率12.87％；EV71和CoxA16合并感染陽性數(shù)為11例，陽性率為0.16％。結(jié)合本地區(qū)與國內(nèi)其他地區(qū)的結(jié)果說明EV71手足口病最常見的病原體［9］。然而各地EV71和CoxA16占手足口病原體的比例存在差異，Yang和Li等［10－11］報(bào)道杭州與武漢等地的EV71和CoxA16病毒感染與本地區(qū)的相近，Lu等報(bào)道廣州地區(qū)EV71的感染明顯高于本地區(qū)［12］。從我們檢測(cè)結(jié)果表明全年均有發(fā)病，以夏、秋季為高發(fā)季節(jié)，5月份病例突然增加，并迅速達(dá)最高峰，10月份發(fā)病人數(shù)開始下降，發(fā)病人數(shù)主要集中在4月～9月。王春榮和Xu等［13－14］報(bào)道濟(jì)南和云南地區(qū)的發(fā)病趨勢(shì)與本地相似，夏季為高發(fā)季節(jié)，5月～7月是發(fā)病高峰期。由此可以推測(cè)手足口病的發(fā)病與季節(jié)有直接的關(guān)系，春夏兩季是手足口病的發(fā)病流行高峰。因此在疾病預(yù)防控制上應(yīng)加強(qiáng)該段時(shí)間的監(jiān)測(cè)與控制，做好消毒及疾病預(yù)防宣傳工作，以防止疾病的暴發(fā)流行［4］。本研究男性發(fā)病人數(shù)多于女性，可能是由于手足口病是由腸道病毒引起的，主要由接觸了帶有病毒的鼻咽排泄物、糞便和皰疹液而感染。而男孩生性好動(dòng)，活動(dòng)范圍大，比女孩更容易接觸被手足口病患者污染過的物品而感染手足口病。手足口重型病例，主要以EV71感染的為主。EV71感染除了引起手足口病以外，還可能引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦干腦炎、無菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等，甚至危及生命，因此在早期檢測(cè)到EV71陽性的病例，需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，預(yù)防病情的加重及并發(fā)癥的發(fā)生［15－18］。

對(duì)于嬰幼兒而言，其免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全成熟，體內(nèi)無相應(yīng)的抗體保護(hù)，機(jī)體的抵抗力相對(duì)較差，容易受到EV的感染［4，17］。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)嬰幼兒特別是5歲以下兒童進(jìn)行EV病毒檢測(cè)和分型。EV感染的早期診斷，不僅能防止疾病的進(jìn)一步惡化，更能避免手足口病在本地區(qū)流行性爆發(fā)［19］。從我們所做結(jié)果來看，RT-qPCR用于腸道病毒的檢測(cè)，對(duì)于疑似手足口病患者，可以做到早診斷、早報(bào)告、早隔離和早治療，能夠廣泛地運(yùn)用于各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。在柳州市4月～9月份手足口病高發(fā)的季節(jié)，對(duì)于出現(xiàn)發(fā)熱及手掌、腳掌、股部或口腔黏膜出現(xiàn)皰疹等疑似手足口病臨床表現(xiàn)的患者，腸道病毒感染的檢測(cè)是必不可少的。

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Analysis of the laboratory diagnosis results of hand-foot-mouth disease in 2014 in Liuzhou city

XU Zehui1,2,LUO Shiqiang1,2,WANG Jingren1,2,CAIPengfei1,2,QIN Xiao1,2,TANG Ning1,2★
(1.Department of Clinical Laboratory,Liuzhou Maternal and Child Care Hospital,Liuzhou,Guangxi,China, 545001；2.Liuzhou Key Laboratory of Birth Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi,China, 545001)

Objective To study the virus subtypes of hand-foot-mouth disease(HFMD)and prevalent features so as to provide scientific basis for the surveillance and control of HFMD.Methods A total of 6 667 specimens were collected from January to December in 2014.Nucleic acid in genotype of enterovirus 71(EV71)and coxsackievirus 16(CoxA16)were detected by real-time quantitative PCR(RT-qPCR).Results 1 310 cases(19.65％),858 cases(12.87％)and 11 cases(0.16％)were positive for EV71, CoxA16 and EV71 combined w ith CoxA16,respectively.Male’smorbidity was higher than that of female’s, and peaks of incidence occurred from April to September.Conclusion EV71 and CoxA16 are the main pathogenic viruses of HFMD in Liuzhou in 2014.Genetic analysis has profound guiding significance for HFMD diagnosis and outbreaks prevention.

Hand-foot-mouth disease；Viral nucleic acids；Prevalent features；Surveillance and controlmeasures

柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2014G020404）

1.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西，柳州545001 2.柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西，柳州545001

★通訊作者：唐寧，E-mail：tn825＠126.com