劉兆峰鐘啟升

·論著·

超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素的探討

劉兆峰1★鐘啟升2

目的建立一種超高效液相色譜儀和三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用測定蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素殘留的方法。方法通過固相萃取富集樣品中的四環(huán)素類抗生素后，使用超高效液相色譜快速分離，三重四極桿質(zhì)譜儀進行定量分析。結(jié)果超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法能定量檢出蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素的殘留，對5μg／L、10μg／L和50μg／L混合標準溶液的相對標準偏差在0.62％～3.79％之間，其檢出限為31.9ng／L～63.4 ng／L，定量限為127 ng／L～254 ng／L，樣品加標回收率在86.9％～98.1％之間。結(jié)論本法快速、準確、靈敏度高，能滿足蜂蜜中5種四環(huán)素類抗生素殘留的檢測。

超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜；四環(huán)素類抗生素；蜂蜜

四環(huán)素類抗生素（tetracyclines，TCs）包括金霉素（chlotetracycline）、土霉素（oxytetracycline）、四環(huán)素（tetracycline）、強力霉素（doxycycline）、去甲基金霉素（demeclocycline hydrochloride）等，是臨床上廣泛應用的廣譜抗生素。然而，不合理地使用該類藥物，如用藥劑量過大、用藥時間過長、濫用藥物及不遵守休藥期提前屠宰等，會導致該類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織及分泌物中。四環(huán)素類抗生素并不能被動物完全吸收，有相當部分以原形或代謝物形式進入食物鏈和環(huán)境中，直接或間接對人體健康造成影響［1］。

近年來，蜂蜜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。我國蜜蜂大多是從國外引進的意蜂，發(fā)病率比較高，雖然國家提倡生物防治，但還是有一部分人用化學藥物、抗生素來給蜜蜂預防和治療疾病，導致蜂蜜中抗生素含量較高［2-3］。因此，迫切需要建立蜂蜜中高效靈敏的抗生素檢測方法。

高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，特別是三重四級桿質(zhì)譜儀可以進行母離子掃描、子離子掃描和中性丟失掃描，由于可以有效排除基質(zhì)離子產(chǎn)生的非目標碎片離子的干擾，優(yōu)化質(zhì)譜檢測信號，有效的防止了假陽性的檢出，具有高的選擇性和靈敏度，對復雜基體中的藥物殘留具有準確的定性能力，是近些年來發(fā)展很快的分析技術(shù)［4-6］。本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用測定蜂蜜中的5種四環(huán)素類抗生素的方法，以給分析檢測人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

本實驗使用超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)（島津，日本）。具體配置為輸液泵LC-30AD×2，在線脫氣機DGU-20A5，自動進樣器SIL-30AC，柱溫箱CTO-30AC，系統(tǒng)控制器CBM-20A，三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040，色譜工作站為LabSolutions Ver.5.53。

1.2 分析條件

液相條件：使用Shim-pack XR-ODS II（2.0mm I.D.×100mm L.，2.2μm粒徑）色譜柱；流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為甲醇；流速為0.25 m L／min；柱溫為室溫；進樣量為20μL；洗脫方式為梯度洗脫，B相初始濃度為20％，洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子化模式為電噴霧離子源（正離子）；離子噴霧電壓為4.5 kV；霧化氣為3.0 L／m in流速氮氣；干燥氣為15 L／m in流速的氮氣；碰撞氣為氬氣；去溶劑管溫度為250℃；加熱模塊溫度為400℃；掃描模式為多反應監(jiān)測（multiple reacting monitoring，MRM），化合物信息和MRM優(yōu)化參數(shù)見表2；駐留時間為10ms；延遲時間為3ms。

1.3 樣品制備

標準溶液配制：稱取適量5種標準物質(zhì)，分別為四環(huán)素、土霉素、去甲基金霉素、金霉素和強力霉素，用甲醇配制1 000mg／L的混合標準儲備液，用甲醇＋0.1甲酸水溶液（V／V，1∶4）稀釋成不同濃度的混合標準工作液。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradientelution

蜂蜜：市售蜂蜜。

樣品前處理方法：蜂蜜樣品的制備、凈化、提取參照《GB／T 23409-2009蜂王漿中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法》［7］。

1.4 加標回收率計算

加標回收率按以下公式計算：加標回收率＝（加標樣品檢出濃度－樣品基質(zhì)中檢出濃度）／加標濃度×100％。

2 結(jié)果

2.1 標準樣品一級質(zhì)譜圖和產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

對5種四環(huán)素標準樣品進行一級質(zhì)譜圖和產(chǎn)物離子掃描。由結(jié)果顯示，5種四環(huán)素均能得到加氫峰，其產(chǎn)物離子碎片均較為豐富。四環(huán)素的一級質(zhì)譜圖見圖1，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖2。土霉素的一級質(zhì)譜圖見圖3，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖4。去甲基金霉素的一級質(zhì)譜圖見圖5，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖6。金霉素的一級質(zhì)譜圖見圖7，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖8。強力霉素的一級質(zhì)譜圖見圖9，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖10。

2.2 標準樣品的MRM色譜圖

圖11為100μg／L 5種四環(huán)素標準樣品在最優(yōu)色譜條件下得到的MRM色譜圖。5種四環(huán)素峰型對稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩(wěn)。

2.3 線性范圍

將0.2μg／L、0.5μg／L、1μg／L、2.5μg／L、5 μg／L、10μg／L、50μg／L、100μg／L和200μg／L不同濃度的混合標準工作液按1.2中的分析條件進行測定，外標法定量。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制校準曲線；所得校準曲線線性關(guān)系良好，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

表2 化合物信息和MRM優(yōu)化參數(shù)Table 2 Compound informations and MRM optimal parameters

圖1 四環(huán)素的一級質(zhì)譜圖Figure 1 Firstordermass spectrum of tetracycline

圖2 四環(huán)素的產(chǎn)物離子掃描圖（CE值-20V）Figure 2 Ion scanning graph of tetracycline products（CE-20V）

圖3 土霉素的一級質(zhì)譜圖Figure 3 Firstordermass spectrum of oxytetracycline

圖4 土霉素的產(chǎn)物離子掃描圖（CE值-19V）Figure 4 Ion scanning graph of oxytetracycline products（CE-19V）

圖5去甲基金霉素的一級質(zhì)譜圖Figure 5 Firstordermass spectrum of ledermycin

圖7 金霉素的一級質(zhì)譜圖Figure 7 First ordermass spectrum of chlortetracycline

圖8 金霉素的產(chǎn)物離子掃描圖（CE值-22V）Figure 8 Ion scanning graph of chlortetracycline products（CE-22V）

圖9 強力霉素的一級質(zhì)譜圖Figure 9 Firstordermass spectrum of doxycycline

圖10 強力霉素的產(chǎn)物離子掃描圖（CE值-19V）Figure 10 Ion scanning graph of doxycycline products（CE-19V）

2.4 精密度實驗

對不同濃度混合標準工作液連續(xù)測定6次，考察儀器的精密度，保留時間和峰面積的重復性結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示：不同濃度標準品保留時間和峰面積的相對標準偏差分別在0.20％～1.34％和0.62％～3.79％之間，儀器精密度良好。

1.四環(huán)素；2.土霉素；3.去甲基金霉素；4.金霉素；5.強力霉素

圖12 無加標蜂蜜樣品樣的MRM色譜圖（檢出1為四環(huán)素）Figure 12 MRM chromatography of non-spiked honey sample（detected 1：tetracycline）

圖13 蜂蜜加標（2μg／kg）樣品的MRM色譜圖Figure 13 MRM chromatography of honey sample adding standard solution（2μg／kg）

表3 校準曲線參數(shù)Table 3 Parameters of calibration curve

表4 保留時間和峰面積重復性結(jié)果（n＝6）Table 4 The repeatability results of retention time and peak area（n＝6）

表5 四環(huán)素類抗生素的檢出限和定量限Table 5 The lim its of detection and lim its of quantitation of tetracycline

2.5 檢出限

配制濃度為為200 ng／L標樣7份，直接進樣分析，將平行7次測定結(jié)果計算標準偏差S，此時檢出限MDL＝3.14×S，定量下限LOQ＝4×MDL。測定結(jié)果如表5所示。

2.6 回收率實驗

以蜂蜜為待測樣品，檢測5種四環(huán)素類抗生素。在2 g蜂蜜樣品中檢出四環(huán)素，濃度為0.249 μg／kg，色譜圖（圖12）峰型平滑、尖銳，其他3種四環(huán)素類抗生素沒有標準峰型出現(xiàn)。為了研究該分析方法對蜂蜜樣品中四環(huán)素類抗生素的實際檢測效果，向蜂蜜樣品中加入濃度為2μg／kg的5種四環(huán)素類抗生素標準物質(zhì)，加標色譜圖（圖13）5種四環(huán)素類抗生素均出現(xiàn)平滑尖銳峰型經(jīng)加標回收率（表6）計算，其平均回收率分別為四環(huán)素98.1％、土霉素95.2％、去甲基金霉素86.9％、金霉素88.3％、強力霉素為98.1％。

3 討論

目前，液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已廣泛用于微生物、蛋白質(zhì)組學、化學生物學等學科，在探究新的機理、新的化合物方面發(fā)揮著越來越重要的作用［8－11］。同時，在藥物和食品殘留分析方面，與蜂蜜中四環(huán)素族檢測傳統(tǒng)標準方法［12］相比，液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測速度更快、定量更準確、分析四環(huán)素類化合物的具體種類更精確，指導食品行業(yè)發(fā)展更有指向性，提供給執(zhí)法部門的數(shù)據(jù)更明確，大大提高了相關(guān)部門的效率。以四環(huán)素、土霉素、強力霉素和金霉素與前處理方法相同的GB／T 23409－2009［7］相比，其加標回收率土霉素（95.2％）比85.2％～120.8％的回收率提高10％左右，四環(huán)素（98.1％）比73.5％～115.4％的回收率提高20％左右，強力霉素（98.1％）比65.8％～115.2％的回收率提高20％左右，

金霉素的加標回收率也有所提高。

使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用測定蜂蜜樣品中的四環(huán)素類抗生素MRM色譜圖峰型對稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩(wěn)，同時校準曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.999 6以上，說明該檢測方法和前處理方法適合檢測蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留，可以進一步研究穩(wěn)定條件，提高檢測精度和準度，使其作為國標或行標被檢測單位所采用。

本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用測定蜂蜜樣品中的四環(huán)素類抗生素殘留量的檢測方法，該方法前處理簡單，分析時間快，靈敏度高，精密度良好，且線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)在0.999 6以上，對5μg／L、10μg／L和50μg／L混合標準溶液的相對標準偏差在0.62％～3.79％之間，其檢出限為31.9 ng／L～63.4 ng／L，定量限為127 ng／L～254 ng／L。通過對市售蜂蜜樣品的測定，能夠檢測出微量四環(huán)素，對蜜蜂樣品進行加標分析，得到樣品加標回收率在86.9％～98.1％之間，證明該方法適合蜂蜜樣品種衡量四環(huán)素的分析檢測。

表6 四環(huán)素類抗生素加標回收率結(jié)果Table 6 The recoveries results of tetracyclines in honey

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Discussion on determ ination of 5 kinds of tetracyclines residues in honey by ultra-performance liquid chromatography coup led w ith triple quadrupole mass spectrometry

LIU Zhaofeng1★,ZHONG Qisheng2
(1.Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China,510180；2.Analytical Center,Guangzhou Branch,Shimadzu(China)Co.,LTD.,Guangzhou,Guangdong,China,510010)

Objective To establish amethod for determ ination of 5 tetracyclines residues in honey by the ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/ MS).Methods A fter concentrated by solid phase extraction,5 tetracyclines in honey were then separated by ultra-performance liquid chromatography and quantified by triple quadrupolemass spectrometry.Results The 5 tetracyclines residues in honey were quantify detected by UPLC-MS/MS.The relative standard deviations of 5 μg/L、10μg/L and 50μg/Lmixed standard solution were in the range of 0.62％～3.79％.The limits of detection and lim its of quantitation were 31.9 ng/L～63.4 ng/L and 127 ng/L～254 ng/L,respectively.The recoveries of three spiked levelswere range from 86.9％～98.1％.Conclusion Themethod of UPLC-MS/MS is rapid,accurate,sensitive and canmeet the requirements for the determination of 5 tetracyclines residues in honey.

Ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/MS)；Tetracyclines；Honey

1.廣東省食品藥品檢驗所，廣東，廣州510180 2.島津企業(yè)管理（中國）有限公司廣州分公司分析中心，廣東，廣州510010

★通訊作者：劉兆峰，E-mail：9016117＠qq.com