婁佑武，吳志勇，王榮民，陳國(guó)良，寧 財(cái)，雷初朝，黃永震＊

（1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌330046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

牛奶和乳制品是人類一個(gè)寶貴的營(yíng)養(yǎng)來源，乳成分可以通過奶牛的營(yíng)養(yǎng)和育種選擇進(jìn)行改善和提高。二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（acyl CoA：diacylgyeerol acyltransferase，DGAT1）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種非常重要的酶，DGAT1是催化甘油三脂（triacylgycer0l，TAG）合成的最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，也是甘油三脂合成過程中唯一的關(guān)鍵酶，其主要機(jī)制是使二酰甘油加上脂肪酸?；纬扇８视?。DGATI在大多數(shù)的組織中具有較高的表達(dá)水平，特別是在乳腺、小腸、睪丸、脂肪組織和皮膚中的表達(dá)量最高，該基因在泌乳、脂肪吸收、脂蛋白組裝和脂肪形成中發(fā)揮著重要的功能［1，12］。

DGAT1在很多物種中是一種含有500個(gè)氨基酸的蛋白，具有較強(qiáng)的疏水性［2］，并具有二聚體和同源四聚體的結(jié)構(gòu)［3］。該酶參與腸道中脂肪吸收、血漿中甘油三脂濃度的調(diào)節(jié)、脂蛋白的組裝、脂肪細(xì)胞中脂肪的儲(chǔ)存、肌肉中能量代謝以及體脂的合成、禽蛋以及卵母細(xì)胞的形成［4，5］。

DGAT1是泌乳性狀候選基因，小鼠缺乏DGAT1會(huì)失去分泌乳的功能［6］。DGAT1基因K232A多態(tài)性對(duì)牛產(chǎn)乳性狀（牛奶產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量和脂肪酸組成）有重要影響［7］。DGAT1基因位于牛的14號(hào)染色體上，研究發(fā)現(xiàn)，與牛奶產(chǎn)量性狀相關(guān)的一個(gè)潛在數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）也定位在牛14號(hào)染色體上［8，9］。

在成熟的蛋白質(zhì)中，DGAT1基因外顯子8的232位氨基酸的改變，即賴氨酸突變?yōu)楸彼岬陌被嵝蛄校╬.Lys232Ala，或表示為K232A）能夠影響牛奶乳脂組成和脂肪含量［10］。奶牛DGAT1基因K232A突變產(chǎn)生的不同基因型之間在305d產(chǎn)奶量，乳脂量和乳蛋白量等差異顯著，該基因多態(tài)及其與產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)，其效應(yīng)在不同國(guó)家的奶牛群體中得到了驗(yàn)證［7－11，13－16］。

江西吉安西雜牛是乳肉兼用型西門塔爾牛與吉安黃牛雜交產(chǎn)生的后代，適應(yīng)性好，具有比吉安黃牛產(chǎn)奶量、乳脂率高的特點(diǎn)，可開發(fā)高乳脂率的牛奶和生產(chǎn)黃油。關(guān)于江西吉安西雜母牛DGAT1基因K232A突變多態(tài)性及其與乳成分性狀的關(guān)系研究尚未見報(bào)道。因此，本研究采用PCR、DNA測(cè)序技術(shù)，酶切和瓊脂糖凝膠電泳等方法檢測(cè)了吉安西雜母牛98頭個(gè)體DGAT1基因的遺傳變異，分析了其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，并對(duì)98頭個(gè)體在該基因K232A突變位點(diǎn)的多態(tài)性與其4個(gè)乳成分指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與數(shù)據(jù)收集

本研究所用98份成年吉安西雜母牛（Xiza cattle，XZ）母牛的血樣，采自江西牛牛乳業(yè)有限公司西雜母牛群，測(cè)定的主要性狀包括：脂肪（Fat）、非脂（Non－fat）、蛋白質(zhì)（Protein）和乳糖（Milk sugar）的百分含量；測(cè)定時(shí)間為2012年1月～2014年12月。

1.2 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的奶牛DGAT1基因的DNA序列（登錄號(hào)：AJ318490），圍繞K232A突變位點(diǎn)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物（Fp：5＇－CACCATCCTCTTCCTCAAGC－3＇；Rp：5＇－CCTCACCATCTCCAGGAGTC－3＇）；引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：10×Buffer（Mg2＋free）2.5μL、Mg＋2＋1.5μL、dNTPs 0.5 μL、FP 0.5μL、RP 0.5μL、DNA 模板（50ng／μL）2μL，加雙蒸水至25μL。

PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

1.3 DNA池的建立、測(cè)序分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

隨機(jī)從提取的所有DNA樣品中選出1／3的樣品，各取5μL，放入同一離心管中，混勻，調(diào)整終濃度為50～60ng／μL，快速建立吉安西雜母?；旌螪NA池。

以DNA池樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，抽取5μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，將目的條帶清晰、明亮的產(chǎn)物，利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化試劑盒進(jìn)行回收及純化（北京天根生物公司），回收產(chǎn)物直接在ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序（上海生物工程有限公司）。將測(cè)序結(jié)果提交http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST 網(wǎng)站比較，以檢測(cè)SNPs位點(diǎn)。

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：抽取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶EaeI消化處理，選用2%（w／v）的瓊脂糖凝膠，電泳50～60min，采用EB染色，分析、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用PopGene軟件進(jìn)行群體遺傳分析，對(duì)觀測(cè)到的基因型進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)基因頻率和基因型頻率、純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。以及對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率分布進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。

采用SPSS軟件（Version 16.0）的 GLM（General Linear Models）程序?qū)?DGAT1基因型與乳成分性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所用動(dòng)物模型為：Yijk＝μ＋Ai＋ Gj＋ Eijk，其中，Y－ijk：個(gè)體乳成分記錄；μ：總體均數(shù)；Ai：年齡效應(yīng)；Gj：基因型效應(yīng)；Eijk：隨即誤差。

2 結(jié)果

2.1 DGAT1基因突變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

經(jīng)DNA池PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，吉安西雜母牛DGAT1擴(kuò)增區(qū)存在一個(gè)K232A的突變位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)也正是限制性內(nèi)切酶EaeI的酶切位點(diǎn)。所以，利用DGAT1基因擴(kuò)增片段中存在限制性內(nèi)切酶EaeI的特異性酶切位點(diǎn)特性，使用EaeI酶切結(jié)合凝膠電泳的RFLP法對(duì)吉安西雜母牛進(jìn)行分型，酶切后KK型片段大小為441bp，AA型片段大小為（239bp＋202bp），KA型片段大小為（401bp＋239bp＋202bp），判型結(jié)果如圖1所示。在所研究群體中，該位點(diǎn)存在多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)3種基因型AA、KA和KK。

圖1 吉安西雜母牛DGAT1基因突變區(qū)2%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 基因型和等位基因頻率及在吉安西雜母牛群體中的遺傳特性

從表1可知，在3種基因型AA、KA和KK中，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。等位基因A和K在西雜母牛群體中的分布頻率分別為0.56和0.44；等位基因A的分布頻率高于K基因。PIC在西雜母牛群體中為0.371（0.25＜PIC＜0.5），屬于中度多態(tài)。平衡檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，吉安西雜母牛群體處于哈德－溫伯平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

對(duì)DGAT1基因突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析，該突變位點(diǎn)在吉安西雜母牛群體中基因型頻率和基因頻率及Ho、He、Ne和PIC結(jié)果見表1。

表1 吉安西雜母牛DGAT1基因K232A遺傳多態(tài)性指標(biāo)

2.3 吉安西雜母牛群體DGAT1基因突變位點(diǎn)與乳成分的相關(guān)分析

在表2中列出了吉安西雜母牛DGAT1基因突變位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的乳脂率、乳非脂率、乳蛋白率和乳糖率的統(tǒng)計(jì)值，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)和多重比較，結(jié)果表明：KA雜合型個(gè)體的在乳脂率、非脂率、乳蛋白率和乳糖率指標(biāo)上都大于KK型AA型的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 吉安西雜母牛DGAT1基因K232A多態(tài)性與生乳檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 DGAT1基因突變多態(tài)性研究

本研究以牛DGAT1基因作為影響奶牛乳成分的候選基因，對(duì)吉安西雜母牛群DGAT1基因外顯子8區(qū)域K232A突變的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，A等位基因是群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因，AA基因型是優(yōu)勢(shì)基因型。野生純合子KK基因型少于突變純合子AA基因型，這種現(xiàn)象顯示在人工選擇，遷移，遺傳漂變過程中，動(dòng)物種群中K等位基因的頻率呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。

3.2 DGAT1基因突變對(duì)乳成分的影響

由于該缺失突變存在于牛DGAT1基因外顯子8區(qū)域，該突變可能對(duì)DGAT1基因自身的翻譯效率產(chǎn)生影響，我們推測(cè)該缺失突變對(duì)奶牛的脂肪合成性狀起了間接的作用。為了證實(shí)外顯子8區(qū)域K232A突變對(duì)牛泌乳性狀的影響機(jī)理，仍需要對(duì)牛DGAT1基因在轉(zhuǎn)錄翻譯水平做進(jìn)一步的研究。

在本研究中，我們對(duì)3種基因型與乳成分進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示：KA雜合型個(gè)體的脂肪、非脂、蛋白質(zhì)和乳糖的百分含量大于AA和KK型。推測(cè)等位基因K和A可能產(chǎn)生互作影響西雜母牛的乳成分。因此，奶牛遺傳育種工作者在西雜母牛選育過程中，應(yīng)當(dāng)盡可能的選擇KA基因型個(gè)體，進(jìn)行擴(kuò)群飼養(yǎng)，不斷提高KA基因型個(gè)體在群體中的頻率，最終育成西雜牛新品系。

3.3 DGAT1基因與泌乳性能的關(guān)系

泌乳性狀是受多基因座位控制的，影響泌乳性狀主基因的確定對(duì)我國(guó)地方黃牛品種向乳用方向培育有重要意義。候選基因法是尋找畜禽QTL一種非常有效的方法，它可以直接研究具有特定功能基因的多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀之間的關(guān)系。已有研究證明，DGAT1基因在動(dòng)物的脂代謝和泌乳過程中起著重要的作用，該基因的突變對(duì)奶牛的乳成分有重要影響。因此，可以被其作為候選基因與數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）作連鎖分析，用于數(shù)量性狀的輔助標(biāo)記選擇。在吉安西雜母牛群體中，已反映出KA基因型個(gè)體比AA、KK基因型個(gè)體在乳成分性狀上有一定的優(yōu)勢(shì)，但還必須擴(kuò)大樣品做進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ Cases S，Smith SJ，Zheng YW，et al.Identification of a geneencoding an acyl CoA：diacylglycerol acyltransferase，a key enzyme in triacylglycerol synthesis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（22）：13018－13023.

［2］ Buhman KK，Chen HC，F(xiàn)arese RV.The enzymes of neutral lipid synthesis［J］.Biol Chem，2001，276（44）：40369－40372.

［3］ Cheng D，Meegalla RL，He B，et al.Human acyl－CoA：diacylglycerol acyhransferase is a tetrameric protein ［J］.Biochemistry，2001，359（Pt3）：707－714.

［4］ Cases S，Stone SJ，Zhou P，et al.Cloning of DGAT2，a second mammalian diacylglycerol acyhrasferase，and related family members［J］.Biol Chem，2001，276（42）：38870－38876.

［5］ Buhman KK，Smith SJ，Stone SJ，et al.DGATI is not essential for intestinal triacylglycerol absorption or chylomicron synthesis［J］.Biol Chem，2002，277（28）：25474－25479.

［6］ Winter A，Krmer W，Werner FA，et al.Association of a lysine－232／alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl－CoA：diacylglycerol acyltransferase（DGAT1）with variation at aquantitative trait locus for milk fat content［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（14）：9300－9305.

［7］ Lu J，Boeren S，van Hooijdonk T，et al.Effect of the DGAT1 K232Agenotype of dairy cows on the milk metabolome and proteome［J］.J Dairy Sci，2015，98（5）：3460－3469.

［8］ Tǎbǎran A1，Balteanu VA，Gal E，et al.Influence of DGAT1 K232Apolymorphism on milk fat percentage and fatty acid profiles in Romanian holstein cattle ［J］.Anim Biotechnol，2015，26（2）：105－111.

［9］ Bennewitz J，Reinsch N，Paul S，et al.The DGAT1K232A mutation is not solely responsible for the milk production quantitative trait locus on the bovine chromosome 14 ［J］.J Dairy Sci，2004，87（2）：431－442.

［10］ Schennink A，Stoop WM，Visker MH，et al.DGAT1underlies large genetic variation in milk－fat composition of dairy cows［J］.Anim Genet，2007，38（5）：467－473.

［11］ Duchemin S，Bovenhuis H，Stoop WM，et al.Genetic correlation between composition of bovine milk fat in winter and summer，and DGAT1and SCD1by season interactions［J］.J Dairy Sci，2013，96（1）：592－604.

［12］ 肖海霞，托乎提·阿及德，田可川，等.哺乳動(dòng)物DGAT1基因的研究進(jìn)展 ［J］.草食家畜，2009，144（3）：7－11.

［13］ 徐秀容，高雪，許尚忠，等.牛DGAT1基因的K232A取代等位基因分布頻率及對(duì)部分胴體性狀的影響 ［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11（4）：11－15.

［14］ 賈晉，馬妍，孫東曉，等.中國(guó)荷斯坦牛DGAT1基因與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（12）：1661－1664.

［15］ 樊月圓，王強(qiáng)，張永云，等.德宏奶水牛DGAT1基因多態(tài)性及其與產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性分析［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，32（6）：27－32.

［16］ 盧振峰，劉莉莉，趙國(guó)麗，等.三河牛DGAT1基因K232A位點(diǎn)與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國(guó)奶牛，2014，32（3）：13－16.