劉向敏， 齊景偉*， 安曉萍， 劉 娜， 羅旭光， 陳大勇

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.內蒙古斯隆生物技術有限責任公司，內蒙古呼和浩特011517；3.內蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司，內蒙古呼和浩特 010011）

近年來，微生物發(fā)酵技術被廣泛應用在飼料工業(yè)中，飼料經發(fā)酵后，不僅適口性增強，難于消化的營養(yǎng)物質、抗營養(yǎng)因子和毒素含量降低，而且還可以提高蛋白質含量，為動物提供有益微生物及其代謝產物，以調節(jié)動物胃腸道的微生態(tài)平衡和提高動物機體的免疫力（陶蕾等，2015；洪峰等，2014）。 用于發(fā)酵飼料的菌種主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌和霉菌（李龍，2010；李永凱等，2009）。

本試驗采用枯草芽孢桿菌與酵母菌混合發(fā)酵，以真蛋白質為評價指標，從菌種的接種比例、腐植酸鈉添加量、麩皮含量、接種量、含水量等方面對奶牛精飼料發(fā)酵進行了研究，為奶牛精飼料的工業(yè)化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌與酵母菌由內蒙古斯隆生物技術有限責任公司保存與提供。

1.1.2 原料 奶牛精飼料、麩皮和腐植酸鈉均從市場購買。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（1 L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏粉 3 g，氯化鈉 5 g。麥芽汁培養(yǎng)基（1 L）：麥牙膏粉130 g，氯霉素0.1 g。以上兩種培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。配制固體培養(yǎng)基時，需加入2%的瓊脂粉。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為奶牛精飼料、麩皮。奶牛精飼料組成如下：玉米蛋白28.65%，豆粕5%，菜籽粕 5%，棉籽粕 7%，DDGS14.5%，鹽 0.8%，蘇打1%，石粉1.7%，尿素0.6%，預混料0.2%，氧化鎂0.15%，氫鈣0.4%，玉米35%。

1.1.4 儀器 可見光分光光度計、離心機、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.5 主要試劑 福林-酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成。A液：4%碳酸鈉溶液與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液等體積混合。B液：1%硫酸銅溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等體積混合。使用前將A與B按50∶1的比例混合即成，當天配制使用。福林-酚試劑乙液，購買于杭州迪測生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子液的制備 枯草芽孢桿菌：將冷凍保存的菌種劃線在滅菌的營養(yǎng)瓊脂平皿中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取3～4個菌落于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，即得種子液。

酵母菌：將冷凍保存的菌種劃線在滅菌的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平皿中，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取3～4個菌落于滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)24 h，即得種子液。

1.2.2 檢測指標 待測液的制備：稱取0.3 g經65℃烘干并粉碎的飼料樣品，加入8 mL蒸餾水，混勻加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻，50℃恒溫水浴鍋水浴1 h，4000 r/min離心5 min，取上清液，即為待測液。

真蛋白質測定方法同趙書景（2008）的測定方法。

1.3 數據處理 數據經Excel 2007初步整理后，用 SPSS 17.0中的單因子方差分析 （One-Way ANOVY），以P＜0.05作為差異顯著水平判斷標準，差異顯著時采用Duncan’s方法對各組間平均數進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對飼料真蛋白質含量的影響 枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例混合發(fā)酵奶牛精飼料，飼料中真蛋白質含量見圖1。

由圖1可以看出，枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可增加飼料中真蛋白質的含量，當枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為3∶7時，真蛋白質含量為18.66%，與原精料相比提高了3.35%（P＜0.05），故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為3∶7?？莶菅挎邨U菌與酵母菌是微生物發(fā)酵技術常用的發(fā)酵菌種 （甄玉國，2005；Antonio 等，2004）。酵母菌菌體蛋白含量高，約占菌體干物質的32%～75%，其細胞壁含有多種生物活性物質，能促進免疫反應，具有益生菌和益生元的特點和作用（朱平軍，2011）?？莶菅挎邨U菌產生的蛋白酶可將大分子蛋白分解為小分子蛋白、肽類和游離氨基酸。兩菌種在飼料發(fā)酵過程中發(fā)揮不同的作用，不同配比將直接影響飼料的品質，而適當的菌種比例會充分體現兩種菌的優(yōu)勢，并促進其共同生長（揣玉多等，2008）。

圖1 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對飼料真蛋白質含量的影響

2.2 種子液中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白質含量的影響 種子液中不同腐植酸鈉添加量對飼料中真蛋白質含量的影響見圖2。

圖2 種子液中不同腐殖酸鈉添加量對飼料真蛋白質含量的影響

由圖2可以看出，種子液中腐植酸鈉添加量為0.5%～2%時，真蛋白質含量隨著腐植酸鈉的增加而增多；腐植酸鈉添加量為2%～8%時，真蛋白質含量隨著腐植酸鈉的增加而降低，當腐植酸鈉添加量為2%時，真蛋白質含量為18.46%，未添加腐植酸鈉組真蛋白質含量為17.25%，兩者相比，種子液中添加2%的腐植酸鈉顯著提高1.21個百分點。

2.3 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白含量的影響 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料中真蛋白質的影響見圖3。由圖3可以看出，發(fā)酵底物中添加不同含量的腐植酸鈉均可明顯提高真蛋白質含量 （P＜0.05），當腐殖酸鈉添加量為0.5% ～2%時，真蛋白質含量隨著腐植酸鈉的增加而增加；腐植酸鈉添加量為2%～8%時，真蛋白質含量隨著腐植酸鈉的增加而降低，當發(fā)酵底物中腐植酸鈉添加量為2%時，真蛋白質含量可達20.13%，未添加腐植酸鈉組真蛋白質含量為18.17%，兩者相比，真蛋白質含量顯著提高1.96個百分點（P＜0.05）。

圖3 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白質含量的影響

2.4 發(fā)酵底物中麩皮添加量對飼料真蛋白質含量的影響 不同的麩皮添加量對飼料中真蛋白質含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵底物中麩皮含量對飼料真蛋白質含量的影響

由圖4可以看出，麩皮添加量為5%～15%時，真蛋白質含量隨著麩皮的增加而增加，與未添加麩皮組相比，差異顯著；當麩皮添加量為15%～20%，隨著麩皮含量的增加，真蛋白質含量逐漸降低。因為5%、10%和15%組真蛋白質含量分別為20.16%、20.21%、20.26%（P＞ 0.05）， 故麩皮最適添加量為5%。麩皮作為一種輔料加入到底物中，不僅可保持發(fā)酵基質的疏松性，而且可維持合適的碳氮比，并為菌體提供生長所需的微量元素（汪倫記等，2012）。

2.5 接種量對飼料真蛋白質含量的影響 合適的接種量可有效促進菌體的生長并分泌代謝物，減少發(fā)酵成本。不同接種量對飼料中真蛋白質含量的影響見圖5。

圖5 接種量對飼料真蛋白質含量的影響

由圖5可以看出，在總接菌量較小的情況下，菌種需要較長時間才能大量生長，對固態(tài)物料利用率低。接種量為2.5%～7.5%，真蛋白質含量隨著接種量的增加而增加；接種量為7.5%～10%，真蛋白質含量隨著接種量的增加而降低?？赡苁怯捎诮泳窟^大，飼料中的水分、營養(yǎng)成分滿足不了菌體的正常代謝，抑制了菌體生長；菌體生長旺盛，固態(tài)發(fā)酵飼料溫度過高，從而影響菌體生長。又因為2.5%、5%和7.5%組真蛋白質含量分別為20.25%、20.35%、20.45%（P＞ 0.05）， 故確定最佳接種量為2.5%。

2.6 含水量對飼料真蛋白質含量的影響 含水量低，使菌體生長受到抑制；含水量過高，發(fā)酵料就會過濕過黏，對發(fā)酵料散熱不利，在好氧發(fā)酵時影響發(fā)酵原料的透氣性和氧氣濃度。不同的含水量對飼料中真蛋白質含量的影響見圖6。

圖6 含水量對飼料真蛋白質含量的影響

由圖6可以看出，含水量為40%～50%時，真蛋白質含量隨著水分的增多而增多，含水量為50%時，真蛋白質含量可達20.26%，顯著高于前三組（P＜0.05）；含水量為50% ～60%時，真蛋白質含量隨著水分的增加而降低，原因可能是過多的游離水分影響了氧氣在物料中的傳遞，使菌體缺氧，影響生長。由此可以得出，最適含水量為50%。

2.7 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質含量的影響 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質含量的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質含量的影響

由圖7可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，真蛋白質含量也相應增加。發(fā)酵早期，菌體對新的生長環(huán)境適應較差，生長緩慢，代謝能力差，因此真蛋白質含量較低，當發(fā)酵時間為 12、24、36、72 h，真蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵時間的延長，菌體數量增多，代謝增強，真蛋白質含量逐漸增高，在48 h時達到最大，為20.16%。與發(fā)酵時間為60 h時差異不顯著（P>0.05），與其他組相比，差異顯著（P＜0.05）。而后，隨著發(fā)酵時間的延長，真蛋白質含量雖有增加，但增幅很小。故確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.8 發(fā)酵溫度對飼料真蛋白質含量的影響 發(fā)酵溫度也是影響微生物發(fā)酵的一個重要因素，過高或過低都不利于菌體的生長。不同的發(fā)酵溫度對飼料中真蛋白質含量的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對飼料真蛋白質含量的影響

由圖8可以看出，隨著溫度升高，真蛋白質含量逐漸增加。當溫度為34℃和36℃，真蛋白質含量分別為20.11%和20.6%，差異不顯著，故確定最佳發(fā)酵溫度為34℃。當發(fā)酵溫度為34℃和36℃時，兩菌種可較好地共生，菌體生長旺盛，對飼料的利用率更高，菌體蛋白大量產生，較大提高飼料中真蛋白質含量。

3 結論

本試驗條件下得到的奶牛精飼料最佳發(fā)酵條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為3∶7，種子液中腐植酸鈉最適添加量為2%，發(fā)酵底物中腐植酸鈉最適添加量為2%，麩皮含量5%，含水量50%，接種量2.5%，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度34℃。在此條件下，真蛋白質含量可達19.94%，與未發(fā)酵組相比顯著提高了4.63個百分點。

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