HPLC法測定大豆磷脂及其保健品中PC、PI、PE

李國輝，鐘其頂，王道兵，高紅波，熊正河，申世剛

（1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“藥物化學(xué)與分子診斷”省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071001；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

HPLC法測定大豆磷脂及其保健品中PC、PI、PE

李國輝1，2，鐘其頂2，王道兵2，高紅波2，熊正河2，申世剛1

（1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“藥物化學(xué)與分子診斷”省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071001；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

建立了高效液相色譜紫外檢測器測定大豆保健品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定方法。采用NH2色譜柱（3.0mm×150mm×5μm），流動相為乙醇∶乙腈∶水=50∶40∶10（體積比），流速0.4mL/min下，紫外檢測器波長為206 nm處進(jìn)行測定。樣品經(jīng)正己烷∶異丙醇=1∶1（體積比）混合液溶解并使用流動相稀釋后直接進(jìn)樣分析。在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999，各添加水平回收率為91.12%～105.61%，RSD為4.85%，日內(nèi)和日間精密度均小于4%，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇定量限分別為1.5mg/L、1.2mg/L和0.9mg/L。本方操作簡單、準(zhǔn)確、成本低，適合于分析大豆磷脂及其保健品中三種主要磷脂的含量。

高效液相色譜；磷脂酰膽堿；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰肌醇

磷脂作為構(gòu)成生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，它不僅以膜（線粒體膜、核膜、細(xì)胞膜，等）的形式存在人體的每一個細(xì)胞中，它還是脂質(zhì)體（Liposome）制備的主要膜材，可在生物體內(nèi)無毒性、無免疫原性降解，同時也可以作為天然的表面活性劑使用，目前廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥、食品、和化妝品等相關(guān)領(lǐng)域[1-2]。依據(jù)來源劃分，磷脂的主來源有大豆磷脂和蛋黃磷脂；大豆磷脂屬于磷脂復(fù)合體，它是由磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）等成分組成，其中前三種最為典型。

隨著脂質(zhì)體開發(fā)技術(shù)的進(jìn)步，純度高、穩(wěn)定性好的磷脂類化合物日益受到重視，其中高純度磷脂類產(chǎn)品更是倍受關(guān)注的焦點(diǎn)?，F(xiàn)今大豆磷脂保健品種類繁多，快速、高效的磷脂類物質(zhì)檢測方法對于及時分析產(chǎn)品以及原料中各類磷脂成分的含量以及精確評價大豆磷脂提取方法尤為重要。目前，磷脂類物質(zhì)的分析測定方法種類較多，主要包括定磷法[3]，薄層層析和薄層掃描色譜法[4-5]、紫外可見光吸收光譜分析法[6]、高效液相色譜法[7-11]、核磁共振光譜分析法[12]和液質(zhì)聯(lián)用法[13-15]等。其中，定磷法操作繁瑣、耗時，并且需要消化、顯色等一系列過程；而薄層掃描和薄層層析法由于其靈敏度較低，噴霧顯色后定量誤差較大，且易受多種因素干擾，目前主要用于定性分析；而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)雖然可以檢測多種磷脂且靈敏度較高，但是儀器要求嚴(yán)格，成本較高。

雖然高效液相色譜法具有分析速度快、靈敏度高、系統(tǒng)密閉性好可以避免不飽和鍵氧化等優(yōu)點(diǎn)，但在磷脂類物質(zhì)測定方面的應(yīng)用還存在一系列問題，例如：前處理操作與洗脫程序較為復(fù)雜，各組分分離效果較差等。目前，國標(biāo)GB/T 21493-2008中推薦了測定大豆磷脂中PC、PE、PI的高效液相測定方法[16]，但是檢測限較高。且方法使用Si-60色譜柱。其他檢出限較低的液相方法在分離柱的填料、流動相的選擇方面也存在差異，不同的樣品前處理與檢測方法同樣會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。本文建立了利用氨基柱分離紫外檢測器測定大豆磷脂及其保健品中PC、PE、PI的高效液相色譜方法，方法操作簡單，靈敏度高，可用于大豆磷脂以及保健品中主要成分的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀，waters2998紫外檢測器，InertsilNH2 column（3.0mm×150mm×5μm），分析天平（精度0.0001g），磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥98%，購自Sigma），磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥98%，購自Sigma），磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥98%，購自Sigma）；乙腈、乙醇、正己烷、異丙醇（色譜純，均購自CNW），實(shí)驗(yàn)室用水為二次蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿0.040 0 g，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇各0.020 0 g，混合后用正己烷/異丙醇（1∶1，V/V）溶解，并定容至10mL。PC、PE、PI的最終濃度為4000、2000、2000mg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液-20℃下儲存。

1.3 樣品處理

直接將大豆磷脂保健品（膠囊需去掉囊衣取出內(nèi)容物）準(zhǔn)確稱取100mg，加入15mL正己烷：異丙醇（1∶1，V/V）混合液中超聲溶解30min，待完全溶解之后定容至25mL，-20℃下儲存?zhèn)溆?。根?jù)樣品標(biāo)識的卵磷脂含量使用流動相稀釋在線性范圍內(nèi)，0.45μm濾膜過濾后測定分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inertsil NH2 column，3.0mm×150mm× 5μm（或性能相當(dāng)）；流動相：乙醇/乙腈/水=50∶40∶10（體積比）；流速：0.4 mL/min，等度洗脫；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：40℃；紫外檢測波長：206 nm。

1.5 定性與定量

根據(jù)PC、PE、PI標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間，與待測樣品中組分的保留時間進(jìn)行比較定性，使用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離度和線性

經(jīng)過調(diào)整流動相中乙醇、乙腈和水的比例，最終確定流動相為乙醇∶乙腈∶水=50∶40∶10（體積比），樣品中PE、PC、PI分離度良好，如圖1所示。

圖1 PE、PC、PI經(jīng)HPLC-UV測定色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatograms of PE，PC and PI.

由于乙醇的最大紫外吸收為196 nm，由樣品空白的色譜圖可知，在PE、PC、PI保留時間處無干擾。取適量混標(biāo)溶液儲備液，使用流動相分別稀釋200、100、50、25、8倍配制系列濃度梯度，進(jìn)樣分析相關(guān)性。如表1所示，各物質(zhì)在濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。與其他的液相色譜方法相比，本文建立的方法出峰時間快，分離度好。

表1 線性與相關(guān)系數(shù)Table1 Inearity and correlation coefficient

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

常規(guī)的使用紫外分光光度法測定的丙酮去油離心、蒸干、乙醇溶解的樣品前處理方法[6，12]無法溶解樣品中的PE，而柱層析[7，17]的前處理方法過于繁瑣。目前，其他相對簡單的前處理方法如樣品直接經(jīng)氯仿/甲醇溶解定容[6]，以及正己烷/異丙醇/冰乙酸的前處理方法[16]的雜質(zhì)干擾較大或需要特殊的色譜柱。

本文建立利用正己烷/異丙醇直接對大豆磷脂以及大豆磷脂保健品進(jìn)溶解定容。大豆磷脂粗制或精制粉狀樣品，可直接稱取0.0100g進(jìn)行溶解定容，軟膠囊類的磷脂保健品需去掉包衣取出內(nèi)容物稱重后溶解定容。對于在溶解過程中存在沉淀的個別樣品，本文對溶解時間進(jìn)行了探索，如圖2所示。

圖2 超聲時間對樣品溶解的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on dissolving samples

在超聲溶解30min時，PC、PE、PI的峰面積之和達(dá)到穩(wěn)定，并且在溶解溶劑使用量加大至20mL時，結(jié)果一致。因此選定超聲溶解的時間為30min，且有沉淀的樣品需離心后取上清定容。

2.3 精密度和重復(fù)性

取同一樣品在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次以及連續(xù)5天進(jìn)樣測定（每天連續(xù)測定3次取平均值），根據(jù)測定結(jié)果分析日內(nèi)精密度和日間精密度。如表2所示。

表2 日內(nèi)和日間精密度Table2 Precision of intraday and interday

方法日內(nèi)精密度和日間精密度均≤4%。因此，本文建立的HPLC測定大豆磷脂中三種主成分含量的方法精密度良好。

2.4 檢出限

依據(jù)S/N=3原則，測得PE、PC、PI的檢出限分別為1.2、1.5mg/L和0.9mg/L。

2.5 加標(biāo)回收率

取定容稀釋后的樣品，分別添加不同濃度的混標(biāo)溶液，分析該方法測定三種大豆磷脂的回收率，結(jié)果見表3。

表3 不同添加水平回收率測定結(jié)果Table3 Recovery rate of PE，PC and PIin different spiked level

該方法對于大豆磷脂三種主成分含量的測定回收率為91.12%～105.61%之間，回收率RSD為4.85%。因此，應(yīng)用本方法測定大豆磷脂中三種主要成分含量的準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品測定

隨機(jī)挑選3個市售大豆磷脂粉和3個大豆磷脂保健品，依照前處理方法將樣品準(zhǔn)確稱重后、溶解定容至25mL。經(jīng)流動相稀釋后測定樣品中PE、PC、PI，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，每一樣品重復(fù)測定3次。之后依據(jù)稱取樣品質(zhì)量計算每100克樣品中PE、PC、PI含量，測定結(jié)果如表4所示。

表4 大豆磷脂樣品及保健品測定結(jié)果（n=3，±s）Table4 Determination results of soybean phospholipids（n=3，±s）g/100 g

表4 大豆磷脂樣品及保健品測定結(jié)果（n=3，±s）Table4 Determination results of soybean phospholipids（n=3，±s）g/100 g

樣品編號 PE PC PI SP1001 24.36±0.41 36.01±0.88 14.27±0.91 SP1003 21.27±0.99 32.55±1.02 12.16±0.31 SF1009 23.91±0.58 39.47±1.12 19.19±0.36 RYX1003 29.53±0.11 40.18±1.26 21.66±0.79 RYX1014 27.22±0.54 38.46±1.42 18.88±0.34 RYX1017 26.61±0.39 31.39±1.75 17.17±0.28

其中，PC、PE、PI含量分別在31～41、21～30、12～30 g/100 g之間，含量結(jié)果基本符合《美國中央大豆公司磷脂指南》中提到的大豆磷脂中PC、PE、PI的含量比例。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法-紫外檢測器建立了大豆磷脂及其保健品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇快速測定方法，并對該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，可廣泛應(yīng)用于大豆磷脂及其保健品中三種主要成分含量的測定，并為其質(zhì)量評價提供可靠依據(jù)。

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Determination of the Concentrations of Phosphatidylcholine，Phosphatidyl Ethanolamine and Phosphatidylinositol in Soybean Phospholipids and Health Care Products by HPLC

LI Guo-hui1，2，ZHONG Qi-ding2，WANG Dao-bing2，GAO Hong-bo2，XIONG Zheng-he2，SHEN Shi-gang1
（1.Key Laboratory of Analytical Science of Hebei Province；Key laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis，Ministry of Education；College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071001，Hebei，China；2.China National Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing100015，China）

A sensitive method for the determination of phosphatidylcholine，phosphatidyl ethanolamine and phosphatidylinositol in soybean phospholipids by high-performance liquid chromatographic analysis is described.A NH2 column （3.0 mm×150 mm×5μm）was used and the isocratic elution mobile phase was ethanol∶acetonitrile∶water（50∶40∶10，v/v/v）.The flow rate was0.4mL/min and the detector was UV with 206nm.The sample was dissolved byn-hexane∶isopropanol（1∶1，v/v）and diluted by mobile phase for analyzed. The correlation coefficient of phosphatidylcholine，phosphatidyl ethanolamine and phosphatidylinositol was greater than 0.999 in linear range.The precision of interday and intraday of the three ingredients were less than 4%and the recoveries were between 91.12%-105.61%.The limit of detection of phosphatidylcholine，phosphatidyl ethanolamine and phosphatidylinositolwere 1.5mg/L，1.2mg/L and 0.9mg/L，respectively.The method is rapid，accurate and reliable，and can be used to determine three main components of soybean phospholipids and health care products.

HPLC；phosphatidylcholine；phosphatidyl ethanolamine；phosphatidylinositol

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.018

2014-07-18

國家自然基金（31101333）；國際合作項(xiàng)目（2011DFA33270）；國家科技支撐計劃（編號：2012BAK17B11）；質(zhì)檢公益項(xiàng)目（編號：201210104）

李國輝（1986—），男（漢），博士研究生，主要從事食品分析研究。

*通信作者：鐘其頂（1980—），男（漢），博士，高級工程師，主要從事食品安全及其真實(shí)性研究。