林巧

（西昌學院，四川西昌615000）

瑞士乳桿菌產生的細菌素的抑菌活性研究

林巧

（西昌學院，四川西昌615000）

主要通過研究對從建昌板鴨發(fā)酵過程中分離瑞士乳桿菌產生細菌素的抑菌活性，考察不同溫度，不同pH，不同種類酶作用對細菌素抑菌活性的影響。結果證明：蛋白酶能一定程度抑制細菌素的抑菌活性，且胰蛋白酶的抑制程度最強；該細菌素的抑菌活性對溫度的耐受力強，即使在100℃處理后仍具有抑菌活性，在-20℃條件下保存時抑菌活性最強；該細菌素pH在1.5～4.0時具有抑菌活性，在pH為1.5時抑菌活性最強。

瑞士乳桿菌；細菌素；抑菌活性

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）是一類革蘭氏陽性、不產生芽孢、接觸酶陰性、能利用可發(fā)酵糖產生大量乳酸的厭氧或兼性厭氧微生物。屬于食品級安全（Generally regarded as safe，GRAS）的微生物，與人類的生活密切相關，它們是人體和動物腸道微生物菌群中的優(yōu)勢種類，具有調節(jié)腸道菌群平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，抑制腸道內腐敗菌的生長以及腐敗產物的形成等作用[1-4]。

瑞士乳桿菌產生細菌素（Bacterioein）是一種殺菌的多肽類活性物質，可以抑制一個廣譜的革蘭氏陰、陽性菌，尤其是抑制一些腐敗菌和病原菌且與鰲合劑結合可以將其活性譜拓寬到革蘭氏陰性菌，因而為食品加工和食品保藏提供了一個新方法。如作為一種安全、無毒、天然的食品防腐劑和抗菌添加劑已被多個國家和地區(qū)廣泛應用在乳制品、罐頭食品上。同時，該細菌素在肉制品發(fā)酵過程中也被認做為一種抑制有害菌的活性物質。如作為抑制有害菌的有效成分，在建昌板鴨發(fā)酵過程中的充分應用[5-8]。

自從瑞士乳桿菌產生的細菌素批準作為食品防腐劑以來，細菌素的研究已成為微生物學研究中的一個活躍領域，研究內容主要涉及細菌素的分離純化，抑菌活性的影響條件和具體影響趨勢，工程菌株的構建以及在肉制品發(fā)酵工藝中的應用等。近年來細菌素的研究雖然在分子水平和應用研究上取得巨大進展，但分離純化率并不理想。

為了更加合理有效地運用細菌素，我們需要對細菌素的一些抑菌性活性進行實驗與理論相結合的方法進行分析。這包括了細菌素的pH適應性、熱穩(wěn)定性，不同種類酶影響等方面的研究，收集各種環(huán)境下細菌素抑菌圈的大小，從而確定不同環(huán)境條件對細菌素抑菌活性的影響程度，為該細菌素在建昌板鴨傳統(tǒng)發(fā)酵工藝過程中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 MRS培養(yǎng)基的制作

其配制方法如下：將酵母粉4.0 g，牛肉粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MnSO40.05 g，吐溫80 1.0g，乙酸鈉5.0g，MgSO40.2g，KHPO 2.0g，溶于1000mL蒸餾水中，并調節(jié)溶液pH為6.1，置于高壓滅菌鍋中121℃，30min滅菌[9-10]，然后將溶液置于36℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1.2 營養(yǎng)瓊脂平板的制作

其制作方法如下：將瓊脂粉45 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、溶解于1 000mL蒸餾水中，然后調節(jié)溶液pH為7.4，加熱溶解，邊加熱邊攪拌，直至溶液中瓊脂粉完全溶解為止，然后將溶液置于高壓滅菌鍋中121℃，30min滅菌，趁熱將瓊脂溶液以每個20mL置于已滅菌的空白平板內，冷卻凝固后得到50個瓊脂平板[11-14]。將平板置于36℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種及其來源

瑞士乳桿菌由西昌學院輕化工程學院生物工程實驗室從建昌板鴨傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中分離，做生化鑒定，確定種屬；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus-aureus）、鏈球菌（Streptococcus）由西昌市華寧公司動物保健中心提供。

1.1.3 試劑

胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，溶菌酶，固體硫酸銨，丙酮溶液，乙醇溶液，鹽酸溶液，氫氧化鈉溶液等。

1.1.4 設備

MJ-250B-Ⅱ微機霉菌培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；不繡鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；臺式離心機：上海安亭科學儀器有限公司；中空纖維濾系統(tǒng)：四川成都愛普科學儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智成儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌素的分離及收集

1.2.1.1 菌種活化

從4℃取出本實驗室保存的瑞士乳桿菌菌種，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱中36℃，24h培養(yǎng)，挑選體積較小、邊緣不整齊、中央突起，表面不光滑、成乳黃色的瑞士乳桿菌接種于1 000mL的MRS液體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中36℃，24 h培養(yǎng)，菌液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 細菌素的分離

將瑞士乳桿菌發(fā)酵液于1 000mL、4℃條件下離心30min，去除菌體，經中空纖維超濾系統(tǒng)處理后，收集含有細菌素的上清液于錐形瓶中，4℃振蕩過夜。

1.2.1.3 低溫有機溶劑萃取

上清液用中空纖維濾系統(tǒng)處理后，分裝在5個錐形瓶中，分別加入等體積丙酮，4℃下沉淀，過濾，沉淀分別用90%乙醇溶液100mL洗滌3次以除去殘留的丙酮。沉淀用500mL蒸餾水溶解于燒杯中，得到溶液。

1.2.1.4 硫酸銨梯度沉淀

將上一步所得溶液經中空纖維濾系統(tǒng)處理后，收集于已稱重的燒杯中，取500 g溶液，加入固體硫酸銨配置成45%硫酸銨飽和液，4℃振蕩過夜。然后在已形成沉淀的飽和液中加入固體硫酸銨，使溶液飽和度由45%上升至60%，4℃振蕩過夜。過夜后再向60%硫酸銨飽和液中加入固體硫酸銨，使硫酸銨溶液飽和度由60%上升至80%，4℃振蕩過夜[15]。

1.2.1.5 細菌素的收集

過夜后的80%硫酸銨飽和液經500 g，4℃，2 500 r/min條件下離心30min，過濾，收集沉淀，分別用90%乙醇溶液100mL洗滌沉淀3次，以除去沉淀上的雜質以及殘留的硫酸銨，再將沉淀用蒸餾水溶解，經800mL，4℃條件下離心30min，去除沉淀，收集上清液，經中空纖維濾系統(tǒng)處理后，收集500mL溶液于錐形瓶中，得到含有細菌素的上清液。

1.2.1.6 細菌素的分離鑒定

采用Sephacryl S-100HR填料柱在Purifier100蛋白質純化系統(tǒng)上進行凝膠過濾，收集有抑菌活性的組分，做酸排除試驗，之后采用HPLC檢測該組分的純度，確定得到的蛋白類活性物質為細菌素。

1.2.1.7 細菌素抑菌試驗指示菌平板的制作

分別取8mL培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液、金黃色葡萄球菌菌液、鏈球菌菌液，用脫脂棉均勻涂抹到已得到的瓊脂平板上，待菌液完全滲入瓊脂平板后，分別得到大腸桿菌指示平板，金黃色葡萄球菌指示平板，鏈球菌指示平板，為細菌素的抑菌試驗做準備。

1.2.2 細菌素的抑菌試驗

取2個大腸桿菌指示平板，用無菌鑷子分別取3個牛津杯貼放于平板表面，各牛津杯對稱放置，相鄰杯中心之間相距25mm以上，各杯與平板的周緣相距15mm以上。放好后，用無菌鑷子輕壓牛津杯，使其緊貼于平板底端，向1個大腸桿菌指示平板的牛津杯中分別加入不同因素處理后的細菌素溶液0.5mL，蓋好平皿，在另外1個大腸桿菌指示平板的中分別加入經37℃，24 h培養(yǎng)后未經處理的細菌素溶液0.5mL以形成對照試驗，做以大腸桿菌為指示菌的牛津杯對照試驗[17-20]。采用同樣的方法，對細菌素分別作以金黃色葡萄球菌，鏈球菌為指示菌的牛津杯對照試驗，選取均勻而完全生長的抑菌圈，用數(shù)顯游標卡尺測量各條件下細菌素抑菌圈的直徑，并記錄測量數(shù)據。

1.3 細菌素抑菌活性的研究

1.3.1 不同溫度對細菌素的抑菌圈影響試驗

將瑞士乳桿菌產生的細菌素溶液，分別在-20、4、37、60、90、100℃下處理60min后，待細菌素恢復至室溫，對細菌素分別做以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌為指示菌的牛津杯試驗，測量并記錄各個溫度下細菌素的抑菌圈直徑。

1.3.2 不同pH對細菌素的抑菌圈影響試驗

取細菌素溶液，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節(jié)細菌素溶液的pH分別為1.5、2.5、3.0、4.0、5.0、8.0，以未經過pH處理的細菌素溶液為對照，將各細菌素溶液置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃，24 h培養(yǎng)。對細菌素分別做以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌為指示菌的牛津杯對照試驗，測量并記錄各條件下細菌素的抑菌圈直徑。

1.3.3 不同酶處理對細菌素的抑菌圈影響試驗

1.3.3.1 酶液的配制

分別取20mg酶加入到20mL滅菌過的無菌雙蒸水中，配制成1mg/mL的酶溶液，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節(jié)胰蛋白酶溶液，胃蛋白酶溶液、蛋白酶K溶液、溶菌酶溶液的H值至最佳酶活力，其pH分別為5.1、2.0、7.5、5.0，將所得的酶溶液置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 酶反應試驗

將細菌素溶液分別與4種酶溶液等體積混合，以加入相應pH的等體積無菌水的細菌素溶液為對照，置于37下反應30min，對細菌素分別做以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌為指示菌的牛津杯對照試驗，測量并記錄各條件下細菌素抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對細菌素的抑菌圈的影響試驗結果

對瑞士乳桿菌產生的細菌素溶液在不同溫度下處理60min后，待細菌素溶液恢復至室溫，對細菌素分別做以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為指示菌的牛津杯試驗，確定不同溫度引起的細菌素溶液的抑菌圈直徑的變化方向及強弱，結果如表1所示。

表1 不同溫度處理的細菌素的抑菌圈直徑Table1 Bacteriocin inhibition zone diameter at different temperatures mm

由表1的結果看出，隨著溫度的增高，瑞士乳桿菌產生的細菌素的抑菌圈直徑變小。這表明瑞士乳桿菌產生的細菌素的抑菌活性有一定下降；但該細菌素溶液在100℃下處理60min后仍具有較強的抑菌活性，這證明該細菌素對溫度的耐受力強，具有良好的熱穩(wěn)定性。導致這種結果的根本原因是瑞士乳桿菌產生的細菌素屬于小分子熱穩(wěn)定性疏水肽類活性物質，隨著溫度升高，該細菌素的熱穩(wěn)定性逐漸減弱，且這種活性物質可耐受至100℃的高溫。該細菌素在-20℃下保存抑菌活性最強，這證明低溫環(huán)境有利于該細菌素的保存。

2.2 不同pH對細菌素的抑菌圈的影響試驗結果

對瑞士乳桿菌產生的細菌素溶液做不同pH處理，以未處理的細菌素溶液做對照，將細菌素溶液置于培養(yǎng)中37℃，24 h培養(yǎng)后，對細菌素溶液分別做以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為指示菌的牛津杯對照實驗，確定不同pH處理引起的該細菌素的抑菌圈直徑的變化方向及強弱，結果如表2所示。

表2 不同pH處理的細菌素的抑菌圈直徑Table2 Different pH value of the meat processing bacteria bacteriostatic circledia meter mm

表2表明，該細菌素的抑菌圈直徑隨著pH的增大而變小，這是由于瑞士乳桿菌產生的細菌素分子量較小，且該細菌素具有嗜酸性而導致的結果。這說明該細菌素的抑菌活性隨pH的增高而降低。該細菌素在pH1.5～4.0時具有抑菌活性，且酸性越高，該細菌素抑菌效果越強。且在pH為1.5時，抑菌活性效果最強。

2.3 不同酶處理對細菌素的抑菌圈的影響試驗結果

將瑞士乳桿菌產生的細菌素溶液分別與4種酶溶液等體積混合，置于37℃下反應30min，以未經過酶處理的細菌素溶液做對照，對細菌素分別做以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為指示菌的牛津杯對照試驗，確定4種酶處理后引起的細菌素溶液的抑菌圈直徑的變化方向及強弱，結果如表3所示。

表3 不同酶處理的細菌素的抑菌圈直徑Table3 Bacteriocin inhibition zone diameter of the different enzyme treatment mm

表3表明，瑞士乳桿菌產生的細菌素溶液在4中不同酶處理后，抑菌圈直徑都有一定下降，尤其是胰蛋白酶處理后，該細菌素的抑菌圈直徑下降特別明顯。這說明4種酶均能在一定程度上減弱該細菌的抑菌活性。其中，胰蛋白酶對細菌素的抑菌活性的減弱影響最強，而溶菌酶對該細菌素的抑菌活性的減弱影響最弱。導致這種結果的根本原因是瑞士乳桿菌產生的細菌素屬于小分子多肽類物質，而蛋白酶類均能分解該細菌素，從而使該細菌素的抑菌圈直徑變小，抑菌活性減弱。其中，胰蛋白酶分解該細菌素的能力最強，溶菌酶分解該細菌素的能力最弱。

3 結論

本試驗證明，瑞士乳桿菌產生的細菌素隨著環(huán)境溫度的升高，其抑菌活性逐漸減弱，所以在建昌板鴨發(fā)酵工藝中，低溫發(fā)酵可更有效的保持細菌素的抑菌活性。該細菌素的抑菌活性隨pH升高而減弱，隨著建昌板鴨發(fā)酵工藝的進行，乳酸菌和酵母菌的數(shù)量增加，使pH降低，而低pH的環(huán)境有利于細菌素發(fā)揮對有害菌的抑制作用。四種酶均能減弱該細菌素的抑菌活性，所以在建昌板鴨發(fā)酵工藝中，可加入抑制酶類作用的活性物質，從而更有效的維持或增強細菌素的抑菌活性。

本實驗最終得到了不同溫度、不同pH、不同酶處理引起的建昌板鴨中分離的瑞士乳桿菌產生的細菌的抑菌活性的抑菌活性的具體變化，為當?shù)匕屮喌囊?guī)?；a和細菌素在發(fā)酵工藝中的進一步應用提供科學理論依據和實驗基礎。

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Bacteriocin Antibacterial Activity Produced by Lactobacillus helveticus Isolated Jianchang Dry-cured Duck

LIN Qiao
（Xichang College，Xichang 615000，Sichuan，China）

The antibacterial activity of this experiment by studying bacteriocins produced by Lactobacillus helveticus was investigated at different temperatures，different pH，different types of enzymes on the antibacterial activity of bacteriocin.Results showed that：proteinase can be a certain extent the antibacterial activity of bacteriocin，trypsin inhibition of the strongest；the antibacterial activity of the bacteriocin on the temperature tolerance and strong，even after treated at 100℃ has antibacterial activity，the st rongest antibacterial activity when stored at-20℃；the bacterial factors pH of1.5 to 4.0 with antibacterial activity and antibacterial activity of the strongest at pH 1.5.

Lactobacillus helveticus；Bacterioein；Antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.029

2014-01-10

四川省教育廳科研基金項目（09ZC005）

林巧（1978—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品生物技術與微生物研究。