不同pH值和活性炭濃度對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響

張文泉，何志國(guó)，楊秀鐘，袁繼林

(1.凱里學(xué)院，貴州 凱里556011；2.國(guó)家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，長(zhǎng)沙 410014，3.黔東南州林業(yè)局，貴州 凱里556000)

不同pH值和活性炭濃度對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響

張文泉1，何志國(guó)2，楊秀鐘3，袁繼林3

(1.凱里學(xué)院，貴州 凱里556011；2.國(guó)家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，長(zhǎng)沙 410014，3.黔東南州林業(yè)局，貴州 凱里556000)

以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用藍(lán)莓當(dāng)年生的幼嫩枝條為實(shí)驗(yàn)材料，研究在不同pH值(5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5)和不同活性炭濃度(0.01%，0.03%，0.05%，0.1%，0.2%)下對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：藍(lán)莓不定芽分化最佳的pH值條件為5.0，最適宜的活性炭濃度為0.1%。

藍(lán)莓；不定芽；pH值；活性炭

藍(lán)莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(VacciniumL.)植物，多為灌木，地理分布比較廣泛[1-2]。藍(lán)莓的果實(shí)和莖葉在食品、醫(yī)藥、化工等方面具很高價(jià)值[3-4]。由于藍(lán)莓中的花青素含量較高，其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)保健功能已為國(guó)際上所公認(rèn)[5-7]，市場(chǎng)前景較好，藍(lán)莓在全國(guó)各地已大規(guī)模種植，有關(guān)藍(lán)莓的快繁技術(shù)報(bào)道較多，但藍(lán)莓的適生環(huán)境為酸性條件，并對(duì)有機(jī)質(zhì)含量要求較高[8-9]，本文就藍(lán)莓組培工廠化育苗過程中，如何調(diào)節(jié)pH值及活性炭濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試外植體

供試外植體是采自凱里學(xué)院藍(lán)莓種質(zhì)園五年生“兔眼”扦插苗的當(dāng)年生幼嫩枝條，枝條直徑為3 mm，長(zhǎng)度為15 cm，切口平整。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒

供試外植體洗凈后，在流水下沖洗12 h，用70%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgC12常規(guī)滅菌10 min，最后再用無菌水沖洗4次，備用。

1.2.2 不同pH條件下藍(lán)莓不定芽分化培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，組成為MS+3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，配置pH分別為5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5六個(gè)不同梯度的固體培養(yǎng)基，取滅菌后的枝條，在無菌條件下，選取帶腋芽的莖段，切成長(zhǎng)度為5～10 mm的外植體，接種于不同pH值的MS培養(yǎng)基上，在溫度(25士1)℃、光強(qiáng)3000 lx、光照(10～14)h∕d的條件下培養(yǎng)40 d，觀察在不同pH條件下，藍(lán)莓不定芽分化的影響，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù),計(jì)算公式為：不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/被誘導(dǎo)的外植體數(shù)。以此為指標(biāo)，選擇合適的pH值。

1.2.3 不同濃度活性炭條件下藍(lán)莓不定芽分化培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，組成MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂的培養(yǎng)基，然后添加0，0.01%，0.03%，0.05%，0.1%，0.2%等不同濃度的活性炭，pH調(diào)至5.0，接種、培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)方法同上步試驗(yàn)，選擇最佳的活性炭濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響

培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)外植體在不同pH值條件下的不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)，得表1，生長(zhǎng)情況如圖1所示，由圖1及表1可看出：pH值對(duì)藍(lán)莓不定芽分化起重要作用。不同pH值條件下，外植體均分化出不定芽，但不定芽誘導(dǎo)率及平均不定芽數(shù)均存在顯著差異，pH值為5.0時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為75%，平均不定芽數(shù)為7.8，而且長(zhǎng)勢(shì)較好，隨著pH值的升高，不定芽誘導(dǎo)率降低，平均不定芽數(shù)遞減，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率低，平均不定芽數(shù)僅為1.3，幾乎不分化，且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。由此可知，pH值為5.0時(shí)，為藍(lán)莓不定芽分化的最佳條件。

表1 不同pH值對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響pH值分化率/%接種數(shù)/個(gè)平均分化芽個(gè)數(shù)生長(zhǎng)情況5 075?247 8++++5 166 7?246 3+++5 254 2?245 2++5 345 8??244 7++5 441 6??243 5++5 537 5???241 3+ 注：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為接種40d后的結(jié)果；?表示差異顯著(P<0 05)；+表示生長(zhǎng)情況：+不好、++一般、+++較好、++++好、+++++很好。

pH值為5.0

pH值為5.5

圖1 不同pH值條件下藍(lán)莓不定芽分化及生長(zhǎng)情況

2.2 不同濃度活性炭對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響

大量組織培養(yǎng)試驗(yàn)證明：活性炭對(duì)不定芽的分化存在一定的促進(jìn)作用。其原因是：活性炭具有吸附性，可以吸附植物組織培養(yǎng)過程中植物生長(zhǎng)所產(chǎn)生的有害物質(zhì)[9-10]。不同活性炭濃度條件下，40 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，平均不定芽數(shù)得表2，測(cè)定不定芽高生長(zhǎng)狀況得圖2，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：添加活性炭對(duì)藍(lán)莓不定芽分化有促進(jìn)作用，隨著活性炭濃度的增加，不定芽誘導(dǎo)率增加，平均不定芽數(shù)增加，不定芽高生長(zhǎng)加大，當(dāng)活性炭濃度達(dá)到0.1%時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到最大為95.8%，平均不定芽數(shù)為10.7，不定芽高生長(zhǎng)達(dá)到最大值，為1.52，當(dāng)活性炭濃度再增加時(shí)，則會(huì)抑制不定芽分化，各項(xiàng)指標(biāo)均降低，因?yàn)榛钚蕴课缴L(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致生長(zhǎng)受抑制。

綜上所述：藍(lán)莓不定芽分化最適宜的活性炭濃度為0.1%。

表2 不同濃度活性炭對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響活性炭濃度/%分化率/%接種數(shù)/個(gè)平均分化芽個(gè)數(shù)生長(zhǎng)情況075???247 8++++0 0179 1???248 1++++0 0387 5??248 7++++0 0591 6?249 3++++0 195 8?2410 7+++++0 283 3??248 4++++ 注：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為接種40d后的結(jié)果；?表示差異顯著(P<0 05)。+表示生長(zhǎng)情況：+不好、++一般、+++較好、++++好、+++++很好。

圖2 活性炭對(duì)藍(lán)莓不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響

3 討論

pH值是植物組織培養(yǎng)的主要影響因子，pH值是否適宜關(guān)系到植物組織培養(yǎng)的成功與否，就植物本身而言，存在適宜的pH值生長(zhǎng)范圍，過高或過低的pH值會(huì)造成鹽堿危害，使植物不能正常生長(zhǎng)，在植物組織培養(yǎng)過程中，pH值同樣影響外植體對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收、多胺代謝、植物激素進(jìn)出細(xì)胞等各項(xiàng)植物生理活動(dòng)，對(duì)外植體的分化和物質(zhì)累積有很大的影響[10-12]。另一方面：pH值影響固體培養(yǎng)基的凝固，pH值過高培養(yǎng)基過硬，影響外植體的成活及生長(zhǎng)，pH值過低，培養(yǎng)基則不能凝結(jié)。藍(lán)莓適宜在弱酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)，在其組培過程中適宜的pH值為成功的關(guān)鍵所在。

由于活性炭的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，活性炭經(jīng)常用于植物組織培養(yǎng)中充當(dāng)介質(zhì)，活性炭的加入，對(duì)植物組織培養(yǎng)過程中植物器官發(fā)生、體細(xì)胞胚發(fā)生產(chǎn)生著正效應(yīng)或負(fù)效應(yīng)。培養(yǎng)基中活性炭對(duì)植物組織培養(yǎng)的促進(jìn)或抑制原因并不單一，存在諸多因素影響。在有些文獻(xiàn)中著重強(qiáng)調(diào)活性炭對(duì)植物組織培養(yǎng)的促進(jìn)作用，但通過本實(shí)驗(yàn)得出：過高濃度的活性炭抑制生長(zhǎng)，因?yàn)榛钚蕴吭谖缴L(zhǎng)抑制物質(zhì)促進(jìn)生長(zhǎng)的同時(shí)，它也吸附培養(yǎng)基中中礦質(zhì)元素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，。活性炭的這種非選擇性吸附對(duì)培養(yǎng)材料可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)作用。據(jù)報(bào)道：活性炭吸附硫胺素、煙酸、吡哆素、葉酸、螯合性離子以及鋅[11-12]。在檸檬桉的組織培養(yǎng)過程中使用活性炭，雖然使得試管苗生長(zhǎng)變快，葉片變大，但試管內(nèi)芽苗分化數(shù)卻下降了[13-14]。在植物組織培養(yǎng)中，沒有哪兩種基因型會(huì)對(duì)某一確定的培養(yǎng)條件產(chǎn)生相同的反應(yīng)，活性炭在離體培養(yǎng)中的促進(jìn)或抑制與許多因素有關(guān)[15]。研究活性炭的吸附機(jī)理、鑒定活性炭的吸附與釋放物質(zhì)對(duì)藍(lán)莓不定芽分化的影響還有待進(jìn)一步研究和探討。

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EffectsofpHandActiveCarbonontheVacciniumSppTissueCulture

ZHANG Wenquan1，HE Zhiguo2，YANG Xiuzhong3，YUAN Jilin3

(1.Kaili University,Kaili 556011，Guizhou，China；2.Central South Forest Inventory and Planning Institute of State Forestry Administration，Changsha 410014,Hunan,China；3.Qiandongnan Forestry Bureau,Kaili 556000,Guizhou,China)

Use the MS medium as basic medium,this paper adopted theVacciniumSppas experimental materials,exploration on how the different pH (5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5) and different concentrations of active carbon (0.01%,0.03%,0.05%,0.1%,0.2%) affect theVacciniumSpptissue culture. Experimental results showed that with pH 5.0 and activated carbon concentration 0.1%,theVacciniumSppcallus induction and adventitious bud differentiation were the best.

VacciniumSpp；adventitious bud；pH；activated carbon

2015—07—30

2015—09—18

黔東南州自然科學(xué)項(xiàng)目(黔東南科合J字[2014]4001)；凱里學(xué)院博士專項(xiàng)課題(凱里學(xué)院科同BS201339)。

張文泉(1984—)，男(漢族)，副教授，主要從事林木菌根生物技術(shù)方面的研究。

S 723

A

1003—6075(2015)03—0055—03

10.16166/j.cnki.cn43—1095.2015.03.013