硝酸鈉和2－溴乙烷磺酸鈉對山羊體外瘤胃發(fā)酵甲烷、氫氣和揮發(fā)性脂肪酸生成的影響

王 榮 譚利偉 王 敏 鄧近平 顏志成 王玉詩 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128;3.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院，北京 100125;4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙 410128)

反芻家畜胃腸道甲烷排放占食入總能的2%～12%，是飼糧能量損失的主要途徑之一，也是人類活動溫室氣體排放的主要來源［1］。其中，約90%的胃腸道甲烷排放產(chǎn)生于反芻家畜瘤胃［2］。因此，反芻家畜胃腸道甲烷減排的重點(diǎn)在于抑制瘤胃甲烷生成。目前，抑制瘤胃甲烷生成主要通過2種機(jī)制:1)利用更低自由能的生物化學(xué)過程競爭甲烷菌生長代謝所需要的底物(氫氣)，從而抑制甲烷生成;2)通過抑制甲烷生成過程中所需要的關(guān)鍵性酶和甲烷菌活性，以達(dá)到減少甲烷排放的目的［3］。

硝酸鈉和2－溴乙烷磺酸(2-bromoethanesulphonate，BES)是2種常用的甲烷生成抑制劑。硝酸鈉抑制甲烷生成的機(jī)制比較復(fù)雜，歸為以下2條:1)瘤胃內(nèi)硝酸鹽降解生成氨氣需要消耗氫氣，而該生物化學(xué)過程所需自由能明顯低于瘤胃甲烷生成過程，硝酸鹽可以競爭甲烷菌生長代謝所需氫氣而阻斷瘤胃甲烷生成;2)硝酸鈉降解過程中產(chǎn)生亞硝酸鈉，累積的亞硝酸鈉會對瘤胃微生物產(chǎn)生毒性，在一定程度上可影響甲烷菌活性［4－5］。BES的結(jié)構(gòu)類似于輔酶M(甲烷形成的關(guān)鍵酶)，可特異性作用于甲烷菌，抑制甲烷菌產(chǎn)甲烷作用最后一步中輔酶的脫甲基還原作用，最終抑制甲烷產(chǎn)生［6－7］。當(dāng)瘤胃氫氣利用生物化學(xué)過程的自由能降低時，瘤胃氫氣生成加強(qiáng)且有利于乙酸生成;當(dāng)瘤胃氫氣利用被阻斷(甲烷菌受抑制)時，瘤胃氫氣生成加強(qiáng)且有利于丙酸生成［8］。這2種不同甲烷抑制機(jī)制可能導(dǎo)致不同的瘤胃氫氣和揮發(fā)性脂肪酸生成模式。本試驗(yàn)通過研究甲烷生成生物化學(xué)代謝產(chǎn)物氣體、氫氣、甲烷和揮發(fā)性脂肪酸等指標(biāo)，揭示不同劑量下硝酸鈉和BES 2種甲烷抑制劑對瘤胃甲烷、氫氣和揮發(fā)性脂肪酸生成模式的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物及瘤胃液采集

試驗(yàn)動物為2只裝有永久性瘤胃瘺管的湘東黑山羊。飼糧精粗比為40∶60，即稻草300 g/d和精料200 g/d，自由飲水。每天08:00和18:00分2次等量飼喂。試驗(yàn)當(dāng)天，在晨飼前1 h，從2只瘺管羊取得新鮮瘤胃液，迅速裝入保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 人工瘤胃培養(yǎng)液

人工瘤胃營養(yǎng)液的配制參照Menke等［9］的方法。將采集的瘤胃液用6層脫脂紗布過濾，量取600 mL的瘤胃液迅速加入到準(zhǔn)備好的400 mL人工瘤胃營養(yǎng)液中(瘤胃液與人工瘤胃營養(yǎng)液體積比為1∶4)，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，其中整個過程的溫度保持在39.5℃，通入純二氧化碳以保持厭氧環(huán)境(以刃天青變成無色來判斷)，用磁力攪拌器攪拌以保持瘤胃液與營養(yǎng)液混合均勻。

1.1.3 甲烷抑制劑

試驗(yàn)用硝酸鈉和BES:從Sigma-Aldrich公司購買，純度≥99.0%。

1.1.4 體外瘤胃發(fā)酵設(shè)備

本研究采用的全自動體外瘤胃發(fā)酵設(shè)備包括厭氧瓶、三通電磁閥、培養(yǎng)箱、壓力傳感器、計算機(jī)和氣相色譜儀［10］。培養(yǎng)箱設(shè)定:振蕩頻率50 r/min和培養(yǎng)溫度39.5℃。厭氧瓶通過導(dǎo)管與三通電磁閥和壓力傳感器連接。壓力傳感器與計算機(jī)連接，每分鐘測定并記錄瓶中壓力，通過壓力與氣體體積間關(guān)系計算氣體產(chǎn)量［11］。三通電磁閥受計算機(jī)控制，當(dāng)厭氧瓶中壓力超過9 kPa，電磁閥打開，厭氧瓶中氣體釋放，并通過導(dǎo)管進(jìn)入氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)測定發(fā)酵瓶頂部空間氫氣和甲烷含量。氫氣(甲烷)產(chǎn)量根據(jù)厭氧瓶頂部空間大小、壓力與氣體體積的轉(zhuǎn)化系數(shù)和氫氣(甲烷)含量進(jìn)行計算，方法參考文獻(xiàn)［11］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)7個組:對照組(無任何處理，A組);硝酸鈉組設(shè)3個添加劑量，分別是0.10、0.20和0.40 mg/mL(N1、N2和 N3組);BES 組設(shè) 3 個添加劑量，分別是 0.63、1.26 和 2.52 mg/L(B1、B2和B3組)。每個培養(yǎng)瓶為1個平行，重復(fù)3次。

1.2.2 體外瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)操作

稱取0.6 g底物(0.3 g玉米粉 +0.3 g稻草秸稈)置入145 mL厭氧發(fā)酵瓶中，分別添加不同劑量的甲烷抑制劑，置于39.5℃的培養(yǎng)箱中預(yù)熱。然后向厭氧發(fā)酵瓶中通入二氧化碳以保證發(fā)酵瓶中為厭氧環(huán)境。最后用瓶口分液器向每個發(fā)酵瓶中加入60 mL人工瘤胃培養(yǎng)液。

1.2.3 發(fā)酵液樣品采集與揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量測定

24 h發(fā)酵終止，取2 mL發(fā)酵液，15 000 r/min和4℃條件下離心10 min，取1.5 mL上清液體，加入0.15 mL 25%偏磷酸固定，靜置 15 min后，－20℃保存。樣品在常溫條件下解凍，15 000 r/min和4℃條件下離心10 min，取0.6 mL裝于測定瓶中，在氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)中測定發(fā)酵液樣品中揮發(fā)性脂肪酸各組分含量，計算產(chǎn)量［10］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

應(yīng)用非線性軟件(NLREG)程序，按照Wang等［12－13］提出的模型對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣曲線進(jìn)行擬合。起始底物降解速率(FRD0，h－1)的計算公式參考 Wang 等［12－13］提出的模型。

數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡單處理，然后采用SPSS 12.0軟件對數(shù)據(jù)利用一般線性模型(GLM)程序進(jìn)行方差(ANOVA)分析和Duncan氏多重比較，使用正交多項(xiàng)比較(orthogonal polynomial contrast)分析各個指標(biāo)隨大黃和大黃素添加量變化的趨勢。P＜0.05時，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鈉和BES對產(chǎn)氣參數(shù)的影響

添加不同劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵氣體的生成曲線具有影響(圖1)。由表1可見，與對照組相比，添加0.4 mg/mL硝酸鈉(N3組)顯著降低了潛在最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和起始底物降解速率(P＜0.05)，分別減少了 46.27%、40.07%、50.00% 和 93.71%。隨著硝酸鈉添加劑量的增加，潛在最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣量和起始底物降解速率均呈線性下降的變化趨勢(P＜0.05)。與對照組相比，隨著BES添加劑量的增加，潛在最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣量呈現(xiàn)下降趨勢，但沒有顯著影響(P＞0.05)。添加 0.63(B1組)和 1.26 mg/L BES(B2組)對起始底物降解速率沒有顯著影響(P＞0.05)，添加2.52 mg/L BES顯著增加了起始底物降解速率(P＜0.05)。與BES組相比，添加高劑量硝酸鈉(0.4 mg/mL)對體外瘤胃發(fā)酵氣體的生成曲線影響更大(圖1)。硝酸鈉添加劑量為0.4 mg/mL時，體外發(fā)酵潛在最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和起始底物降解速率均顯著低于BES組(P＜0.05)。

圖1 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵氣體生成曲線的影響Fig.1 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BES on gas production curve of in vitro rumen fermentation

表1 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 1 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BES on parameters of gas production of in vitro rumen fermentation

2.2 硝酸鈉和BES對甲烷、氫氣含量及產(chǎn)量的影響

不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵甲烷和氫氣的含量和產(chǎn)量的影響見表2，甲烷含量及產(chǎn)量曲線見圖2，生成速率曲線見圖3，氫氣含量及產(chǎn)量曲線見圖4。

表2 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵甲烷和氫氣的含量和產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BESon in vitro methane and hydrogen concentration and production

圖2 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵甲烷含量及產(chǎn)量曲線的影響Fig.2 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BES on methane content and production curves of in vitro rumen fermentation

圖3 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵甲烷生成速率曲線的影響Fig.3 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BESon the velocity curve of methane production of in vitro rumen fermentation

圖4 不同添加劑量硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵氫氣含量及產(chǎn)量曲線的影響Fig.4 Effects of different supplemental levels of NaNO3 and BES on in vitro kinetics of on hydrogen content and production curves of in vitro rumen fermentation

2.2.1 甲烷含量及產(chǎn)量

添加硝酸鈉和BES對24 h甲烷含量及產(chǎn)量的生成曲線影響較大(圖2)。與對照組相比，添加不同劑量的硝酸鈉均顯著降低了甲烷含量及產(chǎn)量(P＜0.05)。添加0.1、0.2 和 0.4 mg/mL 硝酸鈉降低甲烷產(chǎn)量18.46%、34.62%、59.23%。與對照組相比，添加不同劑量的BES均顯著降低了甲烷含量及產(chǎn)量(P ＜0.05)，添加0.63、1.26 和2.52 mg/L BES分別降低甲烷產(chǎn)量 23.85%、49.23%、83.07%(表2)。對照組、硝酸鈉組和添加0.63 mg/L BES的瘤胃甲烷生成速率隨發(fā)酵時間呈不斷下降的趨勢;添加1.26 mg/L BES的甲烷生成速率隨發(fā)酵時間呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢;添加2.52 mg/L BES的甲烷生成速率隨發(fā)酵時間呈先下降后上升的趨勢(圖3)。隨著硝酸鈉和BES添加劑量的增加，甲烷含量及產(chǎn)量呈線性下降的變化趨勢(P＜0.05)。與硝酸鈉組相比，添加高劑量BES(2.52 mg/L)對體外瘤胃發(fā)酵甲烷的生成曲線影響更大(圖2)。BES添加劑量為2.52 mg/L時，甲烷產(chǎn)量及含量均顯著低于硝酸鈉組(P＜0.05)。

2.2.2 氫氣含量及產(chǎn)量

添加0.4 mg/mL硝酸鈉和BES組對氫氣含量及產(chǎn)量的生成曲線均影響較大(圖4)。與對照組相比，添加0.1和0.2 mg/mL硝酸鈉均顯著增加氫氣產(chǎn)量(P＜0.05)，但氫氣含量無顯著變化(P＜0.05);添加0.4 mg/mL硝酸鈉和BES組均顯著增加了氫氣含量及產(chǎn)量(P＜0.05)。隨著硝酸鈉和BES添加劑量的增加，氫氣含量及產(chǎn)量呈線性上升的變化趨勢(P＜0.05)(表2)。當(dāng)硝酸鈉添加0.1和0.2 mg/mL時，氫氣生成曲線與對照組相似;當(dāng)硝酸鈉添加0.4 mg/mL時，氫氣產(chǎn)量及含量在0～24 h呈現(xiàn)不斷上升趨勢，24 h氫氣產(chǎn)量是對照組的13.24倍(圖4)。

添加0.63和1.26 mg/L BES的氫氣含量隨時間(0～16 h)呈現(xiàn)不斷上升的變化趨勢，16 h以后無明顯變化;添加2.52 mg/L BES的氫氣含量隨時間呈現(xiàn)不斷上升變化趨勢;而添加不同劑量BES的氫氣產(chǎn)量均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(圖4)。當(dāng)BES添加2.52 mg/L時，氫氣產(chǎn)量是對照組的13.80倍，與0.4 mg/mL硝酸鈉的氫氣產(chǎn)量無顯著差異(P＞0.05)，兩者氫氣產(chǎn)量顯著高于其他添加劑量的BES和硝酸鈉組(P＜0.05)(表2)。

2.3 硝酸鈉和BES對揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量及組成的影響

由表3可見，不同添加劑量的硝酸鈉和BES對于乙酸的產(chǎn)量無顯著影響(P＞0.05)。硝酸鈉組丙酸產(chǎn)量與對照組無顯著差異(P＞0.05)，而BES組丙酸產(chǎn)量顯著高于對照組(P＜0.05)，并隨著劑量的增加，呈現(xiàn)線性上升的變化趨勢(P＜0.05)。隨著硝酸鈉和BES添加劑量的增加，硝酸鈉組總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量呈現(xiàn)不斷下降趨勢，其中添加0.4 mg/mL硝酸鈉能夠顯著降低總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量(P＜0.05)。而BES組總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量與對照組無顯著差異(P＞0.05)。另外，添加硝酸鈉對乙丙比無顯著影響(P＞0.05)，而BES可以顯著降低乙丙比(P＜0.05)且隨添加劑量增加呈現(xiàn)線性下降趨勢(P＜0.05)。

表3 不同水平硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和組成的影響Table 3 Effects of different levels of NaNO3 and BES on in vitro volatile fatty acids production and molar proportion of individual volatile fatty acids

3 討論

3.1 硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵甲烷生成的影響

硝酸鹽可作為電子受體與甲烷菌競爭氫，抑制甲烷生成［14－15］。另外，硝酸鈉還具有抑菌功能，可能抑制瘤胃微生物活性［16－17］。從化學(xué)計量角度看，硝酸鈉完全還原成氨消耗8個氫，即還原1 mol的硝酸鹽可以降低1 mol甲烷排放。因此，0.10、0.20 和 0.40 mg/mL 硝酸鈉理論上應(yīng)該減少甲烷產(chǎn)量分別為 0.07、0.14 和 0.28 mmol，而實(shí)際甲烷產(chǎn)量分別減少了0.14、0.27 和0.46 mmol，理論值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)測值。這說明，除硝酸鹽作為電子受體抑制甲烷生成外，硝酸鈉的抑菌功能也是導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量減少的另一因子。例如，添加0.4 mg/mL硝酸鈉顯著降低了潛在最大產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率。起始底物降解速率隨硝酸鈉添加劑量增加呈線性下降變化趨勢，結(jié)果說明添加硝酸鈉可能會影響到瘤胃微生物對飼料的降解、消化和利用。在硝酸鹽還原菌的作用下，硝酸鹽很快轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。如果亞硝酸鹽無法快速被降解，造成亞硝酸鹽累積，累積亞硝酸鹽會對瘤胃微生物產(chǎn)生毒性，進(jìn)而會影響瘤胃微生物對飼料的降解、消化和利用，使產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量減少［4］。

與硝酸鹽的抑菌機(jī)制不同，BES通過抑制輔酶脫甲基還原作用，抑制甲烷產(chǎn)生。適量添加BES不影響瘤胃其他微生物活性，對干物質(zhì)消失率和產(chǎn)氣量沒有顯著影響［18］。Nollt等［19］報道，添加0.01和0.03 mmol/L BES可分別減少了24 h甲烷產(chǎn)量的90.6%和93.9%。在本研究中，添加2.52 mg/L(0.012 mmol/L)BES 甲烷產(chǎn)量減少了83.07%。BES對甲烷抑制效果相差10%左右，這是因試驗(yàn)動物品種及飼喂飼糧不同所產(chǎn)生。添加0.63和1.26 mg/L BES對產(chǎn)氣量無顯著影響，而添加2.52 mg/L BES顯著降低了產(chǎn)氣量。Ungerfeld等［20］研究表明，瘤胃內(nèi)氫分壓會抑制微生物能量代謝中呼吸鏈的電子傳遞，進(jìn)而影響瘤胃微生物的活性。添加高劑量BES會降低產(chǎn)氣量，這可能因發(fā)酵瓶中大量氫氣累積抑制微生物能量代謝。

本試驗(yàn)對照組的甲烷生成速率隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)不斷下降趨勢，這是發(fā)酵底物不斷消耗所致。BES組甲烷生成速率隨發(fā)酵時間延長呈先下降后上升趨勢，高劑量組最明顯。這說明，8 h后，BES對甲烷產(chǎn)生的抑制作用出現(xiàn)減弱，甲烷生成速率不斷增加。Tomkins等［21］報道，飼糧中添加BES可以減少甲烷的排放，但是瘤胃微生物對BES有一定的適應(yīng)性。另外，24 h內(nèi)，硝酸鹽對甲烷產(chǎn)生的抑制作用沒有出現(xiàn)減弱，甲烷生成速率隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)不斷下降趨勢。

3.2 硝酸鈉和BES對體外瘤胃發(fā)酵氫氣生成的影響

硝酸鹽還原菌利用氫氣還原硝酸鹽生成氨的過程中所需要的自由能為－254 J/mol，而甲烷菌利用氫氣和二氧化碳合成甲烷所需要的自由能為－16.9 J/mol［22］。與甲烷合成相比，硝酸鹽還原成氨的過程所需要的氫分壓更低。這說明，硝酸鹽可與瘤胃氫反應(yīng)而成為氫池(hydrogen sink)。因此，從理論上講，添加硝酸鹽會減少瘤胃內(nèi)氫氣含量。但試驗(yàn)結(jié)果正好相反。例如，添加0.1和0.2 mg/mL的硝酸鈉氫氣生成曲線與對照組相似，而添加0.4 mg/mL硝酸鈉的氫氣生成曲線呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。這說明，硝酸鈉抑制甲烷生成不僅通過氫池方式，硝酸鹽代謝過程形成中間體亞硝酸鹽毒性可直接抑制抑制甲烷生成。中間體亞硝酸鹽毒性導(dǎo)致氫氣利用速率下降，大量氫氣積累。

與硝酸鹽的抑菌機(jī)制不同，BES通過抑制輔酶脫甲基還原作用來抑制甲烷菌對氫氣的利用［23］。因此，添加BES抑制甲烷產(chǎn)生常常伴隨著大量氫氣的積累。本試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，添加BES增加了氫氣的含量及產(chǎn)量，但其氫氣累積會在8 h后出現(xiàn)拐點(diǎn)，這說明氫氣產(chǎn)生速率出現(xiàn)降低。BES對甲烷菌的抑制作用出現(xiàn)減弱，這是導(dǎo)致氫氣產(chǎn)生速率降低的一個重要原因。與BES組不同，高劑量硝酸鹽的氫氣累積曲線在24 h內(nèi)沒有明顯拐點(diǎn)，這說明硝酸鹽對甲烷菌的抑制作用沒有出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。

3.3 硝酸鈉和 BES對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸生成的影響

揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量和組成是衡量瘤胃發(fā)酵模式的重要指標(biāo)。一方面，硝酸鈉可以作為氫池消耗瘤胃氫，這有助于更多的產(chǎn)氫產(chǎn)物乙酸生成;另一方面，硝酸鈉代謝過程產(chǎn)生的中間體亞硝酸鈉具有毒性，可以直接抑制瘤胃微生物(包括甲烷菌)活性，使氫氣利用率減少，引起氫氣累積，這有助于更多的耗氫產(chǎn)物丙酸生成［24－25］。在本試驗(yàn)中，添加0.1和0.2 mg/mL硝酸鈉的總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量與對照組無顯著差異，但添加0.4 mg/mL硝酸鈉顯著降低了總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量。這從側(cè)面表明，低劑量硝酸鈉同樣會對瘤胃微生物產(chǎn)生毒性。但是，低劑量硝酸鈉所引起瘤胃微生物毒性低于高劑量硝酸鈉。結(jié)果說明，在瘤胃中培育硝酸鹽還原菌對于安全使用硝酸鈉非常重要，否則將引起飼養(yǎng)家畜硝酸鹽中毒。這與目前許多瘤胃微生物試驗(yàn)報告結(jié)果相一致［4，26－27］。

與硝酸鈉不同，在本研究結(jié)果中，添加BES增加了丙酸產(chǎn)量。BES特異性地抑制產(chǎn)甲烷最后一步中輔酶的活性［19］，減少甲烷菌對瘤胃內(nèi)氫的利用，結(jié)果瘤胃內(nèi)氫大量累積，這有助于生成更多耗氫產(chǎn)物(丙酸)和降低乙丙比，發(fā)酵模式趨向于丙酸型發(fā)酵。

4 結(jié)論

①硝酸鈉抑制甲烷生成不僅通過氫池方式，還可以通過中間體亞硝酸鹽毒性參與抑制甲烷生成。氫代謝路徑與硝酸鈉添加量密切相關(guān)。

②BES通過抑制輔酶脫甲基還原作用來抑制甲烷菌對氫氣的利用。氫代謝路徑與BES添加量無關(guān)。

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