楊 亞，袁德義，范曉明，李建波，盧孟柱，陳 軍

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

RHD3遺傳互作因子突變體rren108的表型觀察及遺傳學(xué)分析

楊 亞1，2，袁德義1，范曉明1，李建波2，盧孟柱1，2，陳 軍2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

根毛是植物吸收水分和養(yǎng)料的的重要器官，研究與根毛生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的基因?qū)ε嘤齼?yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹種具有重要意義。作為模式植物，擬南芥是一種理想的根毛研究材料。RHD3基因的主要作用在于維持根毛的頂端生長，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常形態(tài)的維持也有重要作用。但目前對于rhd3 突變體中引起根毛及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)缺陷的機理還不是十分清楚。目前對于rhd3 突變體中引起根毛及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)缺陷的機理還尚未清楚。該研究試圖通過分析對比野生型擬南芥WT、rhd3-1：GFP-HDEL及rren108雙突變體根毛及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，探討RHD3調(diào)控根毛的遺傳互作因子及作用機理。表型統(tǒng)計結(jié)果表明：rren108的平均根毛長度與rhd3-1的根毛長度差異不大，但平均根毛密度僅為rhd3-1突變體的29.5％。且rren108的根毛分布不均勻，根毛形態(tài)也發(fā)生了變異。進(jìn)一步遺傳分析表明，該突變性狀受一對隱性單基因控制。對rhd3-1：GFP-HDEL及rren108的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的觀察表明，rren108的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的連接點較rhd3-1少，且其管狀結(jié)構(gòu)變厚呈塊狀，暗示rren108可能通過參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)控制根毛的。

擬南芥；突變體rren108；RHD3；根毛；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；表型觀察；遺傳學(xué)分析

根是植物生長發(fā)育的重要器官，是植物吸收水分和礦物質(zhì)的主要部位。根系是體現(xiàn)植物生存能力的一個重要性狀，理想的根系是植物生存并適應(yīng)環(huán)境脅迫的有力保障[1-2]。除了主根和側(cè)根外，根毛也是根系的重要組成部分，是根系吸收養(yǎng)料和水分最重要的部位。根毛不僅能夠大大增加根系的表面積，大大增加植物根系對水分及礦物質(zhì)的吸收能力，還能感應(yīng)外部環(huán)境，與土壤共生菌相互作用，并固定植物[3-6]。健康的根毛是林木正常生長的重要保障。因此研究根毛生長發(fā)育調(diào)控的相關(guān)基因?qū)ε嘤齼?yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹種具有重要意義。

近年來，根毛的發(fā)育機理廣受關(guān)注。作為一種模式植物，擬南芥為研究植物的生長發(fā)育、細(xì)胞生物及生理學(xué)提供了許多有用的信息。擬南芥作為根毛發(fā)育研究的基礎(chǔ)，已經(jīng)篩選和積累了大量的擬南芥根毛突變體，rhd3突變體就是其中一個。與野生型相比，rhd3突變體的根毛短且彎曲，根毛長度減少為野生型的三分之一，且根毛呈波浪狀(圖3b，c)。從rhd3 突變體的根毛表型可知，RHD3的主要作用在于維持根毛的頂端生長[7]。同時有研究表明，RHD3基因編碼一種含有GTP酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，介導(dǎo)形成并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)[8]。在野生型擬南芥細(xì)胞中，管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成縱橫交錯的多邊形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3d)。而在rhd3突變體的細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管狀結(jié)構(gòu)及分叉都大量減少(圖3d)。目前對于RHD3對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成中所起的作用以及rhd3突變體中引起根毛缺陷的機理還不十分清楚。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的過程中，RHD3起著重要作用，但該過程并不只有RHD3發(fā)揮作用。為揭示與RHD3具有相互作用關(guān)系，共同維持根毛正常發(fā)育的基因，本文以擬南芥在rhd3突變體為遺傳背景下經(jīng)EMS誘導(dǎo)的得到的rren108突變體為材料，觀察其根毛長度和根毛數(shù)量及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，探討RHD3與該突變基因的相互關(guān)系，以期為RHD3作用機理的進(jìn)一步調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擬南芥材料

哥倫比亞型野生型擬南芥WT(Col-0：:GFPHDEL)，突變體rhd3-1：GFP-HDEL，及rhd3-1：GFP-HDEL種子經(jīng)甲基磺酸乙酯(EMS)處理后自交兩代得到的根毛突變表型能穩(wěn)定遺產(chǎn)的的突變體rren108，由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點實驗室提供。

1.2 突變體表型分析

將WT、rhd3-1及rren108種子先后用75％和100％的酒精滅菌和脫水后，分別播種于08％瓊脂(w/v)的1/2MS培養(yǎng)基中。4℃黑暗冷藏2～4d再移至擬南芥培養(yǎng)室中發(fā)芽和培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(22±2)℃，光暗周期16h/8h，光照強度110umol·m-2s-1。5d后在體視鏡下觀察，分別統(tǒng)計30株WT、rhd3-1及rren108主根成熟區(qū)1.5mm內(nèi)的根毛數(shù)量。同時拍照，用Image J軟件測量根毛長度。

1.3 遺傳分析

取至少200粒rren108與rhd3-1雜交獲得的F2種子按上述方法培養(yǎng)7d后，分別統(tǒng)計突變型表型和rhd3-1表型植株的數(shù)量，進(jìn)行χ2測驗，按照孟德爾遺傳規(guī)律對突變表型是否由單基因控制進(jìn)行分析[9]。

1.4 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察

將野生型擬南芥Col-0：GFP-HDEL，rhd3-1：GFP-HDEL以及rren108在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，分別取葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體根毛表型分析

野生型擬南芥WT，rhd3-1及rren108主根成熟區(qū)1.5mm內(nèi)的根毛數(shù)量如圖1。rhd3-1突變體的平均根毛長度明顯較野生型擬南芥短，為93μm，僅為野生型擬南芥根毛長度的28.3％；rren108的平均根毛長度為101μm，與rhd3-1的根毛長度差異不大。從圖2可知，rhd3-1突變體的平均根毛密度與野生型的相差不大，分別為48/1.5mm和50/1.5mm，與前人的研究結(jié)果基本一致[10]。而rren108的平均根毛密度為13/1.5mm，僅為rhd3-1平均根毛密度的29.5％。同時，rren108根毛分布不均勻，且形態(tài)也發(fā)生了變異(圖3b，c)。

圖1 擬南芥野生型WT，突變體rhd3-1和rren108主根成熟區(qū)1.5mm內(nèi)根毛長度Fig.1 Root hair length of wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108 in taproot mature region within 1.5mm

2.2 突變體遺傳分析

突變體rren108與rhd3-1雜交，F(xiàn)1代所有個體的表型都與rhd3-1一致，表明突變表型受隱性核基因控制。F1自花授粉所得的F2中根毛表型分離模式見表1，從表中可知，rhd3-1表型植株與根毛突變植株的分離比為95：265，卡方檢測結(jié)果為0.542 80＜χ20.05，1=3.84，分離規(guī)律符合孟德爾單基因控制性狀遺傳分離規(guī)律，表明該突變性狀是一個單隱性基因控制的數(shù)量性狀[11]。

圖2 擬南芥野生型WT，突變體rhd3-1和rren108主根成熟區(qū)1.5mm內(nèi)根毛數(shù)量Fig.2 Root hair numbers of wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108 in taproot mature region within 1.5mm

圖3 擬南芥野生型WT、突變體rhd3-1和rren108根毛及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)Fig.3 Root hairs and ER morphology wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108

表1 rren108 與 rhd3-1雜交F2植株分離Table 1 Segregation of F2 populations of rren108 crossed to rhd3-1

2.3 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)觀察

rren108，rhd3-1：GFP-HDEL及WT Col-0：GFP-HDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)C末端融合GFP-HDEL蛋白，在477nm光波照射下，會發(fā)出穩(wěn)定明亮的綠色熒光，能清晰地反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)。rren108，rhd3-1及WT葉片細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)如圖3d。與rhd3-1相比，rren108的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的連接點較少，存在一些不成型的多邊形，且其管狀結(jié)構(gòu)變厚呈塊狀。

3 結(jié)論與討論

擬南芥的根表皮細(xì)胞分生長成根毛(生毛細(xì)胞)和保持無毛的表皮細(xì)胞(非生毛細(xì)胞)[12]。一般情況下，位于兩個皮層細(xì)胞連接處下方的表皮細(xì)胞發(fā)育成生毛細(xì)胞，而位于一個皮層細(xì)胞的正下方的表皮細(xì)胞發(fā)育成非生毛細(xì)胞，這種表皮細(xì)胞根毛分布與皮層細(xì)胞的對應(yīng)關(guān)系稱為位置效應(yīng)[13]。本研究中，rren108的根毛長度較rhd3-1的根毛長度相差不大，但其毛的平均密度明顯較rhd3-1平均根毛密度小，且根毛分布不均勻。可能是由于rren108是影響調(diào)控根毛表皮細(xì)胞分化的基因，rren108的突變導(dǎo)致位于兩個皮層細(xì)胞下方的生毛細(xì)胞命運發(fā)生改變，成為非生毛細(xì)胞。目前，在擬南芥中已經(jīng)證實了一些根毛稀少的突變體。如CPC，TRY，ETC1，WER等MYB家族蛋白，是生毛細(xì)胞的正向調(diào)節(jié)因子[14-15]。這些基因的突變會促進(jìn)擬南芥非生毛細(xì)胞的分化或抑制生毛細(xì)胞形成，導(dǎo)致根表皮細(xì)胞分化為根毛的頻率變小。這些基因或者參與這一途徑的基因的突變，都有可能導(dǎo)致根毛密度變小。

研究結(jié)果還表明，相對于rhd3-1，rren108突變體葉片細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有一些不成型的多邊形，且其管狀結(jié)構(gòu)變厚呈塊狀。細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個高度動態(tài)性的膜系統(tǒng)，其膜結(jié)構(gòu)不斷地進(jìn)行融合和分裂。在成熟細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管狀[16]，有著很高的膜彎曲度[17]。同時，管狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間還能通過膜的融合能形成管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的“三向通道”(three-way junction)結(jié)構(gòu)[18]。在野生型擬南芥的葉片細(xì)胞中，管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成縱橫交錯的多邊形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，延伸至細(xì)胞的各個角落。目前已有研究表明，RHD3是一種存在于管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大G蛋白[19-21]，主要參與管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成[8]。在擬南芥rhd3-1突變體中，管狀連接點及分叉結(jié)構(gòu)都大大減少。從rren108突變體細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有一些不成型的多邊形可以推測，rren108可能是影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的融合相關(guān)的基因。同時，rren108內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管狀結(jié)構(gòu)呈塊狀，表明rren108可能同時也是影響膜彎曲度的基因。

總之，在擬南芥在rhd3突變體為遺傳背景下的rren108突變體不僅根毛數(shù)量和根毛形態(tài)發(fā)生明顯變化，其細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)也發(fā)生變異。表明RHD3與該突變基因共同作用，影響擬南芥根毛表型及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，同時暗示rren108可能通過參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)控制根毛的發(fā)生及形態(tài)變異。而RHD3與該突變基因具體的互作關(guān)系還在進(jìn)一步研究中。

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Phenotypic and genetic characterization of a RHD3 genetic interactor mutant rren108

YANG Ya1,2,YUAN De-yi1,FAN Xiao-ming1,LI Jian-bo2,LU Meng-zhu1,2,CHEN Jun2
(1.Key Lab.of Non-wood Forest Nurturing and Protection of Chinese Education Ministry,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China; 2.State Key Lab.of Tree Genetics and Breeding,Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China)

Root hairs are of great agronomic importance due to their essential roles on mineral and water uptaking in plants,therefore,searching for genes involved in root hair development and their corresponding regulatory mechanisms characterization have great potentials on breeding of non-wood forest cultivars and other plant species.As a well-studied model plant,Arabidopsis(Arabidopsis thaliana)bears a lot of advantages for root hair analysis.RHD3 was identi fi ed as an important root hair regulatory player in Arabidopsis and was found to affect the root hair morphology by root hair tip growth regulation,which is also associated with defects in ER morphology.The seeds of at present,the mechanism of causing induced hairs and endoplasmic reticulum defect in rhd3 mutants is not very clear.The study intends to compare and analyze the differences of root hair and cell endoplasmic reticulum among wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1：GFP-HDEL mutant and rren108,further explores the genetic interaction factors and interaction mechanism of RHD3 regulation to root hairs.The seeds of Arabidopsis rhd3-1：GFP-HDEL mutant were treated with Ethyl Methane Sulfonate(EMS)and an stable double mutation line rren108 was obtained.The phenotypic statistical results show that the average length of root hairs of rren108 seedlings was comparable to that of rhd3-1,but the root hair density in rren108 seedlings reduced to 29.5％compared to that of rhd3-1; The root hairs of rren108 were also abnormal both in morphology and distribution.The genetic analysis reveals that the root hair phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.The examination of the ER morphology indicates that the connection points of the endoplasmic reticulum in rren108 mutants were less than that of rhd3-1 mutants,and the rren108 mutants’ tubular structure became thickened and showed a blocky state,revealing that the rren108 mutants may control the occurrence of root hair through endoplasmic reticulum structure.

Arabidopsis thaliana; mutant rren108; RHD3; root hair; endoplasmic reticulum; phenotypic observation; genetic analysis

S718.46

A

1673-923X(2015)07-0110-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.020

2014-10-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2013AA102702)

楊 亞，碩士研究生

陳 軍，副研究員，博士；E-mail：chenjun@caf.ac.cn

楊 亞，袁德義，范曉明，等.RHD3遺傳互作因子突變體rren108的表型觀察及遺傳學(xué)分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2015,35(7)：110-114.

[本文編校：吳 毅]