鐘 潔，王義強,b,c，華漣灘，王啟業(yè)，羅 浪

(中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；b.生物技術(shù)實驗室；c.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，，湖南 長沙 410004)

基于楊木纖維發(fā)酵產(chǎn)丁醇工藝條件的研究

鐘 潔a，王義強a,b,c，華漣灘a，王啟業(yè)a，羅 浪a

(中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；b.生物技術(shù)實驗室；c.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，，湖南 長沙 410004)

丁醇作為新一代生物燃料，已經(jīng)成為世界研究的熱點。利用本實驗選育的丁醇高產(chǎn)突變株——拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57，以楊木蒸汽爆破渣為原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇。結(jié)果表明：楊木蒸汽爆破渣糖化液經(jīng)分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵，丁醇產(chǎn)量分別為2.19、1.79g/L；進而對同步糖化發(fā)酵條件進行正交設(shè)計優(yōu)化，優(yōu)化后同步糖化發(fā)酵得到的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為2.16、3.44g/L，比之前提高了20.7％、16.7％。該研究首次探討了楊木纖維發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝條件，為進一步提高產(chǎn)量提供了基礎(chǔ)。

生物燃料；丁醇；楊木纖維；拜氏梭菌U-57；同步糖化發(fā)酵

能源的利用和再生已成為制約人類社會生存和發(fā)展一大限制因數(shù)。隨著世界經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，石油、天然氣、煤炭與核能等化石能源被廣泛發(fā)掘利用，但是，化石能源將在21世紀上半葉接近枯竭[1]。石化資源的耗竭以及溫室效應的日趨嚴重，促使人們尋找環(huán)境友好型，經(jīng)濟可行性，能夠替代化石能源的新能源。丁醇作為燃料，其熱值和汽油相當，在能源方面顯示出無與倫比的優(yōu)越性[2-3]。

傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵以淀粉、糖蜜為主要原料，國內(nèi)生物丁醇生產(chǎn)主要以木薯、玉米等糧食為主。蘇海鋒、楊登峰[4]以木薯為原料，經(jīng)過逐步馴化Clostridium beijerinckii NCIMB 8052的丁醇耐受性后，在180h得到的丁醇的產(chǎn)量為7.3g/L；裴建新、左文樸等[5]利用玉米為原料，在添加了5％的葡萄糖的培養(yǎng)基中獲得的丁醇產(chǎn)量為10.05g/L。在糧食短缺與能源危機的雙重威脅下，探索纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料丁醇成為生物質(zhì)能源發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分。Ziyong Li[6]等利用麥麩進行72h發(fā)酵后，得到的丙酮、丁醇、乙醇的產(chǎn)量分別為：2.2h/L、8.8g/L、0.2g/L；Qureshi N[7]研究發(fā)現(xiàn)Clostridium beijerinckii P260利用86g/L小麥秸稈水解液(相當于62g/L葡萄糖)可產(chǎn)生25g/L的總?cè)軇?丙酮、丁醇和乙醇)?？梢?，木質(zhì)纖維在代替以往的糖蜜、糧食發(fā)酵生產(chǎn)丁醇具有不可估量的潛力[8]。本文以楊木為原料，其不僅具有早期速生、適應性強、分布廣、生物量高和存量巨大等特點，而且還是木料加工業(yè)的重要原料，也是潛在的重要能源作物之一[9-10]。通過蒸汽爆破方法對楊木進行預處理，將獲得的楊木爆破渣經(jīng)纖維素酶水解所得的糖化液，然后發(fā)酵產(chǎn)丁醇，分別從分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵兩個工藝初步探討丁醇及總?cè)軇┑漠a(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌 種

拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57，由美國菌種保藏中心拜氏梭菌 Clostridium beijerinckii ATCC 55025經(jīng)本實驗室紫外誘變選育獲得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，注冊號為CCICC M 2013208。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：葡萄糖5.0g、酵母浸粉3.0g、胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、三水合乙酸鈉3.0g、氯化鈉5.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、蒸餾水1.0L，pH值 6.8。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25.0g/L、酵母浸粉1.5g/L、硫酸銨3.0g/L、七水硫酸鎂 0.37g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、七水合硫酸亞鐵0.015g/L、碳酸鈣4.45g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.75g/L、蒸餾水1.0L，pH 值 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：楊木爆破渣糖化液1L，酵母浸粉1.5g/L、醋酸銨3.82g/L、七水硫酸鎂0.2g/L、磷酸二氫鉀0.75g/L、七水合硫酸亞鐵0.02g/L、碳酸鈣2.60g/L、硫酸錳0.01g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，調(diào)pH值到6.8。

1.2 方 法

1.2.1 楊木爆破渣糖化液的制備

將楊木爆破渣于烘箱中烘干至恒重，準確稱取烘干后的楊木爆破渣50.0g，加入蒸餾水1.0L，115℃高壓蒸汽滅菌20min，纖維素酶載入量為20 FPIU/g，經(jīng)0.45μm無菌濾膜過濾，靜置45h后可得楊木爆破渣糖化液。

1.2.2 楊木蒸汽爆破渣酶解條件的確定

(1)酶解溫度的確定：選取溫度分別為30、35、40、45、50、55、60℃，pH值為溶液自然pH值，每組3個平行，酶解48h后測酶解液中還原糖含量。

(2)酶解pH值的確定：固定溫度為最適酶解溫度，選取初始pH值為3、4、4.5、5、5.5、6、6.5，每組3個平行，酶解48h后測酶解液中還原糖含量。

(3)酶解時間的確定：固定溫度及pH值為最適值，酶解的過程中分別按9、18、27、36、45、54、63h取樣，每組3個平行，測酶解液中還原糖含量。

1.2.3 分步糖化發(fā)酵

利用上述酶解條件，以楊木爆破渣酶解后的糖化液作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁醇。發(fā)酵培養(yǎng)基見1.1.2，發(fā)酵條件為溫度37℃，發(fā)酵pH值為6.5，接種量6％，裝液量為85％，厭氧發(fā)酵84h。5個平行，每隔12h取樣測發(fā)酵液中溶劑含量和殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.4 同步糖化發(fā)酵

將纖維素的水解和菌株發(fā)酵產(chǎn)丁醇的過程在同一容器內(nèi)連續(xù)進行，同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基見1.1.2，發(fā)酵條件與分步糖化發(fā)酵相同，以發(fā)酵液中溶劑含量和殘?zhí)呛繛橹笜?，探討同步糖化發(fā)酵的結(jié)果。

1.2.5 同步糖化發(fā)酵實驗條件優(yōu)化

(1)單因素試驗：溫度上，分別選取37、38、39、40、41、42、43℃做單因素試驗，其余條件為發(fā)酵pH值 6.5，接種量6％，裝液量為85％，以溶劑產(chǎn)量為指標，每組3個平行。固定溫度為最適發(fā)酵溫度，選取發(fā)酵pH值分別為5.5、5.7、5.9、6.1、6.3、6.5，其余同上；固定溫度及pH值為最適值，選取接種量分別為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％，裝液量為85％，每組3個平行，測定厭氧發(fā)酵72h后的溶劑產(chǎn)量。

(2)同步糖化發(fā)酵條件的正交試驗：在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，對溫度、發(fā)酵pH值、接種量進行正交實驗，從而確定較佳的發(fā)酵條件組合。

1.2.6 檢測方法

(1)還原糖含量測定采用DNS法[11-15]

(2)丁醇氣相檢測方法：將發(fā)酵液于12 000r/min下離心10min，取上清液，重復上述操作一次，0.45μm孔徑濾膜，過濾。氣相色參數(shù)如下，色譜柱：安捷倫HP-INNOWAX，30m×0.25mm；檢測器：FID；以氮氣為載氣，流速為35mL/min，氫氣流速為35mL/min，空氣流速為350mL/min；初始柱溫45℃，保留1min，然后以5℃/min升至150℃，保留2min；進樣口溫度為180℃；檢測器溫度為200℃；進樣量為1μL，分流比為1∶60，外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 楊木蒸汽爆破渣酶解條件的確定

楊木爆破渣酶解后所得還原糖含量的多少，直接影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。通過溫度、pH值和時間3個單因素試驗，確定楊木蒸汽爆破渣最適酶解條件，試驗結(jié)果如圖1、2、3所示。

圖1 酶解溫度對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different temperature on production of reducing sugar

圖2 初始pH值對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on production of reducing sugar

圖3 酶解時間對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on production of reducing sugar

以還原糖產(chǎn)量為考察指標，不同酶解溫度對酶解效果的影響見圖1。從圖1可知，當酶解溫度較低時，還原糖產(chǎn)量并不高，這可能是由于溫度過低，酶的活性不高從而影響纖維素酶的酶解效果；當酶解溫度從30℃升至50℃時，隨著酶解溫度的升高，還原糖的產(chǎn)量也逐漸增加，在50℃時達到最高值，可見50℃有可能是此纖維素酶的最適溫度。當溫度繼續(xù)上升時，還原糖的產(chǎn)量反而降低，這可能是高溫引起此酶的活性中心改變而導致酶失活，因此選擇的酶解溫度為50℃。

pH值能改變蛋白質(zhì)分子的電荷，從而影響酶的活性。不同初始pH值對酶解效果的影響見圖2：當 初始pH值較低時，還原產(chǎn)量很低，當pH值=3時，還原糖產(chǎn)量不足6g/L，較低的pH值嚴重抑制酶的活性；當初始pH值為5.5時，還原糖產(chǎn)量達到最大。進一步升高pH值時，還原糖產(chǎn)量呈現(xiàn)不增反減的趨勢，因此選擇的酶解初始pH值為5.5。

酶解時間的充分與否直接影響還原糖的產(chǎn)量。在一定范圍內(nèi)，酶解時間越長，酶與底物的反應越充分，還原糖產(chǎn)量越高；但長時間的酶解又會使已還原產(chǎn)物發(fā)生部分的氧化，從而且造成時間與物質(zhì)的浪費。不同酶解時間對還原糖產(chǎn)量的影響見圖3：由圖可知，隨著時間的增加，還原糖產(chǎn)量也隨之增加；在54h時達到最大，54h后還原糖含量有輕微的降低，同時由于還原糖在45h時跟54h時的產(chǎn)量相差不大，綜合考慮，選擇的酶解時間為45h。

綜合以上實驗確定了楊木蒸汽爆破渣適宜酶解條件為：溫度為50℃，初始pH值為5.5，時間為45h。該條件下，50g楊木蒸汽爆破渣酶解后還原糖平均產(chǎn)量為21.14g。

2.2 分步糖化發(fā)酵結(jié)果

分步糖化發(fā)酵結(jié)果見圖4。由圖可知，24h之前，丁醇和總?cè)軇?丁醇、丙酮和乙醇)產(chǎn)量增長緩慢，還原糖的消耗曲線與溶劑增長曲線相比較陡；24～60h丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量極具增加，同時伴隨著還原糖的迅速消耗；60h后，丁醇和總?cè)軇┘斑€原糖含量曲線均接近直線。根據(jù)微生物典型生長曲線[12]可知：發(fā)酵初期，菌體生長處于延滯期，對發(fā)酵培養(yǎng)基的適應需要一定時間，從而對還原糖的需求不是太大，因而溶劑產(chǎn)量低；24h后，菌體生長進入指數(shù)生長期，導致還原糖迅速消耗，發(fā)酵產(chǎn)物開始累積；60h后，菌體生長進入穩(wěn)定期，溶劑產(chǎn)量增加非常緩慢。發(fā)酵72h的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別2.19、3.57g/L，低于相同質(zhì)量葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)量(丁醇3.07g/L、總?cè)軇?.25g/L)，究其原因，可能是由于楊木蒸汽爆破渣酶解糖化液中存在某些對菌體正常代謝有抑制作用的物質(zhì)，這還需要做進一步的實驗進行考察。

圖4 分步糖化發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Result of step by step hydrolysis and fermentation(SHF)

2.3 同步糖化發(fā)酵結(jié)果

從圖5可知，24h前，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量低，24～60h丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量增加迅速，60h后丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量的增加非常緩慢。在整個發(fā)酵過程中，還原糖濃度維持在1.28～2.30g/L之間。發(fā)酵初期，菌體生長繁殖緩慢，溶劑產(chǎn)量低，可能是菌體在對新環(huán)境的適應；24h至60h，菌體數(shù)量對數(shù)增漲，生長代謝旺盛，溶劑產(chǎn)量增加較迅速；60h后，由于還原糖的消耗，缺乏發(fā)酵底物，菌體生長代謝受到抑制，因此溶劑產(chǎn)量曲線處于持平狀態(tài)。發(fā)酵84h測得最大丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為1.79、2.88g/L，低于分步糖化發(fā)酵?？赡苁且驗榫w生長代謝所需要的適宜條件與酶解的適宜條件存在著矛盾，因此進一步對同步糖化發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2.4 同步糖化發(fā)酵的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗結(jié)果

發(fā)酵溫度對同步糖化發(fā)酵影響結(jié)果見圖6。從圖中可知，適當?shù)奶岣甙l(fā)酵溫度，能提高丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量，但是溫度高于40時，溶劑產(chǎn)量卻迅速降低。由此可見，之前確定的最適酶解溫度(50℃)并不適宜菌體的生長代謝。高溫可能導致菌體內(nèi)一些組成酶發(fā)生變性失活，甚至能使菌體死亡。因此選擇的最適發(fā)酵溫度為40℃。

圖5 同步糖化發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Result of simultaneous sacchari fi cation and fermentation(SSF)

圖6 發(fā)酵溫度對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of temperature on simultaneous SSF

發(fā)酵pH值對同步糖化發(fā)酵影響結(jié)果見圖7。從圖中可知，當初始pH值為5.9時，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量達到最大，高于或低于這個值，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量都呈下降的趨勢。但纖維素酶的最適酶解pH值為5.5，菌體適宜生長發(fā)酵pH值為6.5，因而在低pH值有利于酶解而不利發(fā)酵，高pH值有利發(fā)酵而不利酶解的矛盾中，選擇的初始pH值為5.9。

圖7 發(fā)酵pH值對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of initial pH on simultaneous SSF

接種量對同步糖化發(fā)酵影響結(jié)果見圖8。從圖中可知，接種量在4％之前，隨著接種量的增加，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量也相應增大，在4％時達到最大；接種量超過4％，繼續(xù)增大接種量，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量反而降低。接種量較低時，菌體需要消耗更多的營養(yǎng)進行生長繁殖來增加菌體數(shù)目，從而導致代謝產(chǎn)物較少；當接種量過大時，菌體對發(fā)酵液的營養(yǎng)迅速吸收，造成酶解的還原糖供不應求，不利于代謝產(chǎn)物的累積，從而導致溶劑產(chǎn)量降低。因此選擇的接種量為4％。

圖8 接種量對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of inoculums volume on simultaneous SSF

2.3.2 同步糖化發(fā)酵條件的正交實驗

在同步糖化發(fā)酵條件單因素實驗的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵所需的溫度、pH值、接種量做進一步做正交實驗，采用L9(34)正交表設(shè)計實驗，因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

通過L9(34)正交表設(shè)計的方案，進行發(fā)酵實驗，每組3個平行，正交實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

對正交實驗結(jié)果進行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 正交實驗方差分析和顯著性檢驗?Table 3 Variance analysis and significant test of orthogonal experiments

從表3可知，C對丁醇的產(chǎn)量的影響顯著，A和B有影響但不顯著。A、B和C 3因素對丁醇產(chǎn)量的影響主次順序為C＞A＞B，即接種量＞溫度＞初始pH值。從表4.3可知，發(fā)酵的最佳條件為A2B1C2，與正交試驗結(jié)果直觀分析得到的最優(yōu)發(fā)酵條件A2B2C2不一致，因此需要對兩組條件進行驗證實驗。驗證實驗結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化驗證試驗結(jié)果Table 4 Verified experiment results of optimization of fermentation conditions

從表4可知，A2B2C2條件組合丁醇產(chǎn)量和總?cè)軇┊a(chǎn)量大于A2B1C2條件組合。因此，通過正交實驗優(yōu)化適宜的發(fā)酵條件組合為：溫度40℃、初始pH值 5.9、接種量為4％，此時發(fā)酵得到的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為2.16g/L、3.44g/L，比之前提高了20.7％、16.7％。

3 結(jié) 論

對楊木蒸汽爆破渣酶解糖化條件進行了探討，確定了酶解糖化適宜的條件組合：溫度50℃、時間45h、初始pH值 5.5。在此條件下，50g楊木蒸汽爆破渣酶解糖化后含還原糖21.14g，還原糖得率達42.28％。在此基礎(chǔ)上，對楊木蒸汽爆破渣糖化液進行了分步糖化發(fā)酵實驗，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為2.19、3.57g/L。同時對楊木蒸汽爆破渣進行了同步糖化發(fā)酵，得到丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為1.79、2.88g/L；進而通過正交試驗對同步糖化發(fā)酵條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別提高了20.7％、16.7％。該研究首次探討了楊木纖維發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝條件，為進一步提高產(chǎn)量提供了基礎(chǔ)。

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Study on fermentation condition for producing butanol from poplar fi bers

ZHONG Jiea,WANG Yi-qianga,b,c,HUA Lian-tana,WANG Qi-yea,LUO Langa
(a.Biotechnology Lab.of Central South University of Forestry and Technology; b.Key Lab.of Non-wood Forest Nurturing and Protection of China Education Ministry; c.Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,Hunan,China)

Butanol,as a new generation of biofuel,has become one of the research hotspots in the world.The high-yield mutant strains(Clostridium beijerinckii U-57),was bred by author in the early days of the study,and by taking the aspen steam explosion residues as the raw materials,the butanol was produced with fermentation process.The results show that the aspen steam explosion residue sacchari fi cation liquid were treated through separate hydrolysis fermentation and simultaneous sacchari fi cation fermentation(SSF),and butanol was obtained,the yield of butanol were 2.19g/L and 1.79g/L,respectively; By optimizing the conditions of SSF,the production of butanol and total solvent were 2.16g/L and 3.44g/L,which were 20.7％ and 16.7％ higher than before.This study fi rstly discussed the fermentation condition of poplar fi ber to produce butanol,which provides some foundations to enhance the yield of butanol.

biofuel; butanol; poplar fi ber; Clostridium beijerinckii U-57; simultaneous sacchari fi cation and fermentation

S792.11

A

1673-923X(2015)07-0125-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.023

2014-10-10

國家林業(yè)局“948”項目(2011-4-13)

鐘 潔，碩士研究生

王義強，教授，博士生導師，E-mail：wangyiqiang12@163.com

鐘 潔,王義強,華漣灘,等.基于楊木纖維發(fā)酵產(chǎn)丁醇工藝條件的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2015,35(7)：125-130.

[本文編校：吳 毅]