涂 佳，艾文勝，楊 明，蒲湘云，孟 勇，李美群

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

毛竹筍醋醋酸菌的篩選

涂 佳，艾文勝，楊 明，蒲湘云，孟 勇，李美群

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

以商業(yè)醋酸菌、紅曲醋分離的醋酸菌、山西陳醋分離的醋酸菌和筍醋自然發(fā)酵的醋酸菌為發(fā)酵菌種，采用純化培養(yǎng)、產(chǎn)酸定性試驗(yàn)初篩出4株醋酸菌。再經(jīng)過耐酒精試驗(yàn)，產(chǎn)酸速度試驗(yàn)和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，得到一株醋酸菌Z2。結(jié)果表明：確定醋酸菌Z2產(chǎn)酸速率快、產(chǎn)酸酸度高，遺傳較穩(wěn)定，對(duì)其進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析鑒定為巴氏醋酸桿菌。

毛竹；毛竹筍；毛竹筍醋；醋酸菌；篩選

竹筍自古以來(lái)就是我國(guó)“菜中珍品”，其口感香脆，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者歡迎。湖南地區(qū)竹筍資源豐富，毛竹春筍發(fā)筍期時(shí)間集中，發(fā)筍量大，隨著春季氣溫的升高，采收后的毛竹春筍易出現(xiàn)脫殼、纖維化、褐變老化現(xiàn)象，限制了毛竹春筍的大規(guī)模流通和生產(chǎn)加工[1]。

醋作為我國(guó)傳統(tǒng)的食品之一，距今已有3000多年歷史[2]。在中國(guó)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們物質(zhì)生活水平的提高、消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變以及對(duì)醋功能了解的加深、消費(fèi)口味的變化適應(yīng)，醋作為飲料逐漸被人們所接受。目前高檔果醋飲品、果醋保健品等果醋產(chǎn)品在歐美、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家市場(chǎng)廣闊[3]。而發(fā)達(dá)國(guó)家的果醋發(fā)展歷史正是我們國(guó)家果醋市場(chǎng)的發(fā)展方向。由此開發(fā)毛竹筍醋這種天然發(fā)酵果醋飲料的大市場(chǎng)正在孕育形成，并將不斷地發(fā)展。毛竹筍醋能充分還原竹的原始風(fēng)味，在功效和經(jīng)濟(jì)上都具有合理性。它還能彌補(bǔ)竹類功效飲料市場(chǎng)的產(chǎn)品，適應(yīng)市場(chǎng)的多元化需求。

該研究的目的在于為開發(fā)毛竹筍醋提供發(fā)酵技術(shù)支撐。毛竹筍醋的研制能為竹筍的加工利用開辟新途徑，打破竹筍用于制筍干、保鮮筍和玉蘭片的傳統(tǒng)局面。毛竹筍醋加工設(shè)備簡(jiǎn)便，同時(shí)加工原料要求低，加工筍干和保鮮筍的加工剩余物都可以利用，不僅解決了大量鮮筍鮮銷不完的困境也解決了筍干和保鮮筍加工剩余物污染環(huán)境的弊端。

在毛竹筍醋生產(chǎn)中，醋酸菌的性能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、發(fā)酵效率和產(chǎn)品中活性因子的含量有很大影響。所以，篩選適合毛竹筍醋生產(chǎn)的醋酸菌是毛竹筍醋開發(fā)過程中的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 醋酸菌

AS 1.41、HNCC3.008(購(gòu)自湖南省微生物研究所)、HNCC3.004(購(gòu)自湖南省微生物研究所)、A1-5(紅曲醋分離)、S1-5(山西陳醋分離)、Z1-5自然發(fā)酵筍醋中分離。

1.1.2 原 料

毛竹春筍原料采自湖南省湘潭市林業(yè)科學(xué)研究所和望城縣烏山林場(chǎng)

1.1.3 試 劑

酵母膏、葡萄糖、瓊脂粉、無(wú)水乙醇、氯化鐵、碳酸鈣、氫氧化鈉，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒

1.1.4 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：1g酵母浸膏，lg葡萄糖，1.5g碳酸鈣，96.5mL蒸餾水，自然pH值于高壓殺菌鍋121℃滅菌30min，冷卻后加2mL無(wú)水乙醇備用。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5％的瓊脂于121℃滅菌30min，冷卻備用。

保藏培養(yǎng)基：1％酵母浸膏，l％葡萄糖，1.5％碳酸鈣，1.5％瓊脂，自然pH值，接種前加2％(v/v)無(wú)水乙醇，接種后32℃培養(yǎng)48h后液體石蠟封存冷藏[4]。

1.2 方 法

1.2.1 菌種分離篩選流程

菌種→活化→增殖培養(yǎng)→稀釋分離→純化→定性試驗(yàn)→斜面保藏→初篩→復(fù)篩→菌種鑒定

1.2.2 菌種活化過程

商業(yè)菌種活化：用浸過75％酒精的脫脂棉擦凈安瓿瓶，用酒精燈外焰加熱安瓿瓶頂端，待玻璃燒紅后滴少量無(wú)菌水于安瓿瓶頂端使之破裂，用剪刀輕輕敲碎安瓿瓶。加入少量無(wú)菌水入安瓿瓶?jī)?nèi)，搖勻后吸取0.1mL菌液瓊脂斜面上，剩余的菌液注入液體培養(yǎng)基內(nèi)，在32℃溫度下培養(yǎng)[5]。

1.2.3 菌種純化

取一定醋液，接種于液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速115r/min，32℃震蕩培養(yǎng)48h后，1mL增殖液，用無(wú)菌水稀釋到10-5、10-6、10-7、10-8濃度，取各濃度稀釋液0.2mL，均勻涂布接種于固體培養(yǎng)基上。32℃培養(yǎng)72h后，挑選透明圈大，菌落豐厚，且占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單菌落進(jìn)行純化[6]。將純化后的菌落接種于保藏培養(yǎng)基中。

1.2.4 醋酸菌定性試驗(yàn)

將純化后的醋酸菌接種于液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48小時(shí)后，取出液體培養(yǎng)基在2 000r/min離心20min后，吸取10mL上清液，用0.01mol/L氫氧化鈉中和至pH7.0，將中和液體煮沸后加入5滴8％氯化鐵溶液，如果有紅褐色沉淀即為醋酸菌[7]。

1.2.5 初篩方法

將分離純化的菌株斜面活化，接種到液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，以10％的量接種量接種到酒精度為10°Be′的竹筍酒的液體培養(yǎng)基中，放入振蕩培養(yǎng)箱中于 115r/min，32℃培養(yǎng)，發(fā)酵15天后，測(cè)總酸含量，同時(shí)比較各菌株發(fā)酵效果，選出酸味濃郁，產(chǎn)酸量高的菌株[8]。

1.2.6 復(fù)篩方法

經(jīng)過初篩的保存菌種經(jīng)過斜面化后，接種到液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后接入竹筍汁發(fā)酵酒液中，接種量為10％，32℃，115r/min培養(yǎng)48h，測(cè)發(fā)酵液總酸。綜合比較各個(gè)醋酸菌的發(fā)酵性能，最終篩選出合適竹筍酒發(fā)酵醋母[9]。

1.2.6.1 酒精耐受性

將初篩的4種醋酸菌分別于6°Be′、8°Be′、10°Be′，12°Be′、14°Be′竹筍酒含量的液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為115r/min，32℃培養(yǎng)15天，測(cè)總酸含量mg/100mL[10]。

1.2.6.2 產(chǎn)酸速率

將初篩的4種菌種按10％(v/v)的接種量接入含有10°Be′竹筍酒液體培養(yǎng)基中，32℃靜止培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)至第2、4、6、8、10、12、14、16d時(shí)測(cè)其產(chǎn)酸量，從中篩選出產(chǎn)酸性能良好的醋酸菌[11]。

1.2.6.3 發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定：

發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率=[產(chǎn)酸量/(發(fā)酵酒精含量×1.304)]×100％，其中，產(chǎn)酸量的單位為g/L；

1.2.6.4 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

在固體斜面培養(yǎng)基中將Z2傳代5次，觀察培養(yǎng)后的菌落特征和革蘭氏染色后的形態(tài)。含有10°Be′竹筍酒液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為115r/min,32℃培養(yǎng)15天，測(cè)定每代的總酸含量。

1.2.7 總酸含量的測(cè)定：GBT5009.41-2003

將篩選出的醋酸菌分別接種于含有竹筍酒的液體培養(yǎng)基中，于恒溫箱32℃培養(yǎng)3d后取3mL發(fā)酵液，加20mL蒸餾水，3滴0.5％酚酞酒精溶液，同時(shí)只用pH計(jì)，用標(biāo)定0.01mol/L 的NaOH溶液滴定至pH8.2同時(shí)顏色變?yōu)闇\粉紅色；其中，由耗用的NaOH溶液的體積計(jì)算樣品中的含酸量(以醋酸計(jì))。

式中：X：試樣中總酸的含量，g/100ml；V1測(cè)定用試樣液滴定耗用的NaOH的體積數(shù)，mL；V2試劑空白滴定耗用的NaOH的體積數(shù)，mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.060為醋酸的分子量；V試樣體積，mL。

1.2.8 菌種鑒定16S rDNA

1.2.8.1 醋的預(yù)處理

取30g濕重醋醅樣品，用150mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)懸浮，收集上清。上清液9 000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀(菌體)。磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體，9 000r/min離心5min。-20℃凍存[12]。

1.2.8.2 樣品總DNA提取

樣品4℃ 9 000r/min 離心5min，棄上清，加入600mL預(yù)熱的CTAB。4℃ 9 000 rpm離心10min，取上清。加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)混勻，4℃ 9 000r/min離心5min。取上清，加入等倍體積的異丙醇，4℃ 10 000r/min離心5min。取沉淀，加1mL 75％酒精洗滌2～3次，4℃ 10 000r/min離心2min。取沉淀，加入1mL無(wú)水乙醇，-20℃靜置1h后，4℃ 10 000r/min離心5min。去上清，干燥沉淀。加1mL Rnase，30mL LTE完全溶解DNA[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)結(jié)果

通過產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，18株醋酸菌AS 1.41、HNCC3.008、HNCC3.004、A1-5、S1-5、Z1-5 離心上清液均與氯化鐵絡(luò)合成紅褐色的沉淀，證明18株菌種均為醋酸菌。

2.2 菌種的初篩

將商業(yè)菌種AS 1.41、HNCC3.008、HNCC3.004和自行分離純化的菌種H1-5，S1-5，Z1-5進(jìn)行初篩。以10％的接種量接種到酒精度為10°Be′的竹筍酒的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后總酸含量見表1。由表1可以看出H2、H3、H4、Z1、Z2、Z3、Z4 均超過 3g/100ml。

醋酸菌在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)消耗培養(yǎng)皿中的酒精，將乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┰僮優(yōu)橐宜?。乙酸可以與培養(yǎng)基中碳酸鈣發(fā)生反應(yīng)在培養(yǎng)基上形成透明圈，產(chǎn)酸越強(qiáng)透明溶鈣圈就越大。結(jié)合總酸含量及溶鈣圈大小作為篩選菌種的標(biāo)準(zhǔn)，選出溶鈣圈排名前四的H2、H3、Z2、Z3進(jìn)行復(fù)篩。

表1 各醋酸菌初篩產(chǎn)酸量Table 1 Acid yield of preliminary selected strains

2.3 菌種復(fù)篩

2.3.1 菌株的酒精耐受性

由圖1可知，隨著酒精度的提升H3和Z2的產(chǎn)酸能力越來(lái)越大。H2酒精度到12°Be′時(shí)產(chǎn)酸能力最大，之后就逐漸降低。Z3酒精耐受性較差，當(dāng)酒精度為10°Be′時(shí)達(dá)到產(chǎn)酸能力高峰，之后產(chǎn)酸能力逐漸減弱。由此得出Z2和H3的酒精耐受性是最好的。

圖1 4種菌株的酒精耐受性Fig.1 Tolerance of 4 strains to ethanol

2.3.2 菌株產(chǎn)酸速度試驗(yàn)

從圖2可以看出，Z2發(fā)酵的前8天產(chǎn)酸速度較慢，發(fā)酵的第8天到第10天產(chǎn)酸速度有個(gè)突越。H3發(fā)酵的前10天速度很慢，發(fā)酵的第10天到第12天產(chǎn)酸速度有個(gè)突越。Z2的發(fā)酵突越時(shí)間較早，且產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。

圖2 2株菌株的醋酸產(chǎn)酸速度Fig.2 Acetic acid producing speeds of 2 strains

2.3.3 菌種的發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率

Z2菌株在竹筍酒精度為12°Be′時(shí)，分別在第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天計(jì)算其發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率見表2。當(dāng)發(fā)酵的18天發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高穩(wěn)定值98％。

2.3.4 遺傳穩(wěn)定性

將Z2斜面培養(yǎng)傳代5次，觀察菌落特征和革蘭氏染色后的個(gè)體形態(tài)均一致，個(gè)體形態(tài)正常。各代產(chǎn)酸能力見表3。

由表2可知，Z2在傳代過程中遺傳到第四代開始，產(chǎn)酸能力有所下降，下降幅度僅為2.3％，穩(wěn)定性比較好。

表2 Z2菌株不同時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率Table 2 Percent conversion of fermentation and producing acid of Z2 strains at different time

表3 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Results of genetic stability tests

2.4 16S rDNA鑒定

2.4.1 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系(10mL)Buffer 1mL dNTP 0.75mL DNA 0.5mL primer+ 0.5mL primer- 0.5mL Taq酶 0.1mL水6.65mL共 10mL

PCR擴(kuò)增條件，94℃ 預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火 30s，72℃延伸30min，循環(huán)35次。72℃延伸10min，4℃保持，1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，95 V 30min檢測(cè)擴(kuò)增片段，見圖3。16S擴(kuò)增中正負(fù)引物分別為27F和1492R。

圖3 Z2的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of Z2

2.4.2 測(cè)序基序列分析

挑選陽(yáng)性克隆送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序，序列在NCBI上和GenBank中的比對(duì)數(shù)據(jù)，在比對(duì)匹配度最高的結(jié)果中，菌種的所測(cè)得到的16S rDNA 序列部分與Acetobacter pasteurianus(巴氏醋酸桿菌)的16S rDNA 序列有99％的同源性，可確定菌屬為Acetobacter pasteurianus(巴氏醋酸桿菌)，將其命名為Z2巴氏醋酸桿菌。

3 結(jié) 論

從 AS 1.41、HNCC3.008、HNCC3.004、A1-5、S1-5、Z1-5中篩選醋酸菌，篩選出耐酒精性能優(yōu)良、產(chǎn)酸速度快、遺傳穩(wěn)定的醋酸菌Z2。可由此菌株發(fā)酵獲得高醋酸轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸量高的醋。經(jīng)過16SDNA測(cè)序鑒定，該菌株為巴士醋酸桿菌，并將其命名為Z2巴士醋酸桿菌。

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Screening for Acetobacter spp.form spring shoot of Phyllostachys pubescens vinegar fermentation

TU Jia,AI Wen-sheng,YANG Ming,PU Xiang-yun,MENG Yong,LI Mei-qun
(Hunan Academy of Forestry,Changsha 410004,Hunan,China)

Commercial acetic acid bacteria,acetic acid bacteria isolated from red yeast rice vinegar,acetic acid bacteria isolated from Shanxi vinegar and acetic acid bacteria isolated from bamboo vinegar were used as the fermentation bacteria.By adopting puri fi cation culture method,producing acid qualitative test,four strains of acetic acid bacteria were preliminarily screened out.Through alcohol resistance test,acid production rate test and the genetic stability test,an acetic acid bacteria Z2 was selected.The results show that：the obtained Z2 had high acid production rate,high yield,high acidity and high hereditary stability.By 16SrDNA sequencing analysis,Z2 was identi fi ed as Acetobacter pasteurianus.

Phyllostachys pubescens; moso bamboo spring shoot; mao bamboo vinegar; acetic acid bacteria; screening

S795.9；TS201.3

A

1673-923X(2015)07-0131-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.024

2014-10-10

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD21B03)；長(zhǎng)沙市科技局富硒筍定向高效培育及低碳加工關(guān)鍵技術(shù)研究

涂 佳，助理研究員，博士；E-mail：65198218@qq.com

涂 佳，艾文勝，楊 明，等.毛竹筍醋醋酸菌的篩選[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,35(7)：131-135.

[本文編校：吳 毅]