王銀龍 單鐵英 潘秀蘭河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 邯鄲 056002

成肌細(xì)胞治療DMD模型-mdx鼠體內(nèi)骨骼肌細(xì)胞dystrophin/utrophin蛋白的表達(dá)

王銀龍 單鐵英 潘秀蘭
河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 邯鄲 056002

目的 研究成肌細(xì)胞移植入放療的mdx鼠后dystrophin/utrophin的表達(dá)變化。方法 培養(yǎng)大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞株（L6SkM），進(jìn)行肌內(nèi)注射于Duchenne型模型鼠-mdx鼠。移植后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月分別取實(shí)驗(yàn)鼠的四肢骨骼肌，運(yùn)用免疫熒光法、Western blot檢測(cè)dystrophin及utrophin的表達(dá)情況。另分別取5只正常C57BL/6鼠和mdx鼠作陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果 成肌細(xì)胞移植后1、2和3個(gè)月后mdx鼠的dystrophin表達(dá)隨移植時(shí)間延長增多，而utrophin的表達(dá)隨移植時(shí)間延長下降。結(jié)論 成肌細(xì)胞移植后dystrophin表達(dá)對(duì)utrophin有一定的抑制作用，兩者存在互補(bǔ)關(guān)系。

成肌細(xì)胞；mdx鼠；細(xì)胞移植；抗肌萎縮蛋白；utrophin

成肌細(xì)胞移植（myoblast transfer thearpy，MTT）是用外源性正常的成肌細(xì)胞注射到宿主的肌細(xì)胞中，使之互相接觸，按肌纖維細(xì)胞正常發(fā)育的成熟程序而相互融合成異核、多核的肌纖維細(xì)胞，從而誘導(dǎo)形成新的、健康的dystrophin陽性的肌纖維。Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥是一種X-性連鎖隱性遺傳病，在男性活嬰中的發(fā)病率為1/3 500，居神經(jīng)遺傳病之首［1］，一般3～5歲起病，常于20～30歲死于呼吸和（或）循環(huán)衰竭。病因主要由于X染色體短臂2區(qū)1帶（Xp21）基因突變導(dǎo)致細(xì)胞膜骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白（dystrophin）缺乏所致，病程進(jìn)展快，預(yù)后差，目前臨床尚無有效治療方法［2］。

組織發(fā)生學(xué)表明，成肌細(xì)胞是骨骼肌前體細(xì)胞，來源于中胚層干細(xì)胞，隨著胚胎的發(fā)育，成肌細(xì)胞分裂、融合到肌管而形成多核的骨骼肌纖維細(xì)胞［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，DMD模型mdx鼠由于抗肌萎縮蛋白的同源蛋白u(yù)trophin表達(dá)上調(diào)，可部分補(bǔ)償抗肌萎縮蛋白功能使其肌肉萎縮的癥狀較輕［5］，干細(xì)胞移植后證實(shí)來自供體的干細(xì)胞可在受體mdx鼠體內(nèi)表達(dá)抗肌萎縮蛋白，但移植后utrophin表達(dá)情況較少見報(bào)道。本研究將L6骨骼肌成肌細(xì)胞（L6SKM）移植入放療的mdx鼠檢測(cè)dystrophin及utrophin的表達(dá)變化，以評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植的治療效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞株（L6SkM）（上海中華細(xì)胞庫）；PBS和DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）。山羊正常封閉血清、兔正常封閉血清（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；兔抗dystrophin多克隆抗體及兔抗utrophin多克隆抗體（Santa-Cruz公司）；山羊抗兔IgG二抗（Santa-Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 受體鼠為齡鼠8～10周mdx鼠10只，購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，體質(zhì)量16～20g，雌雄不限，平均分為5組，設(shè)為未移植組和L6SKM細(xì)胞移植1、2和3個(gè)月組，另取5只正常C57BL/6鼠作陽性和陰性對(duì)照

1.3 L6SkM的培養(yǎng) 復(fù)蘇的L6SkM接種在75cm2培養(yǎng)瓶，加DMEM培養(yǎng)基（含10％新生牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）置5％CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h換液，為保持其理想未分化狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60％～70％匯合時(shí)，即進(jìn)行傳代。取3～5代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 成肌細(xì)胞的肌內(nèi)注射 mdx鼠和C57BL/6鼠，于注射前1周輕微擠壓雙下肢肌肉，注射前1d，用環(huán)孢素A 50 mg·kg-1·d-1皮下注射抗排斥反應(yīng)，直至實(shí)驗(yàn)取材。注射前用戊巴比妥30mg/kg腹腔內(nèi)注射輕度麻醉動(dòng)物，剪開下肢皮膚，用30號(hào)微量注射針（直徑30μm）沿45°斜角，相隔約1 mm，3個(gè)點(diǎn)將成肌細(xì)胞注射于脛骨前肌和腓腸肌。每只鼠的對(duì)側(cè)下肢用DMEM培養(yǎng)基注射做對(duì)照。mdx鼠分成2組（1個(gè)月、2個(gè)月齡鼠各6只），成肌細(xì)胞注射劑量為50×104μL；C57BL/6鼠分2組（鼠齡分組與mdx鼠相同），成肌細(xì)胞注射劑量同mdx鼠。C57BL/6鼠于細(xì)胞移植后1～10d取骨骼肌觀測(cè)注射細(xì)胞分布情況，mdx鼠于移植后2周～3個(gè)月取肌內(nèi)組織檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5 冰凍切片制備及免疫熒光檢測(cè)dystrophin及utrophin的表達(dá) 冰凍切片制備：取各組新鮮鼠的腓腸肌標(biāo)本放于液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍3～5s，然后放入-25℃恒冷切片機(jī)中行橫斷面冰凍切片，-70℃保存。

免疫熒光檢測(cè)：空氣風(fēng)干15min，PBS水化5min共3次，3％H2O2封閉10min，即用型山羊血清封閉30min，1：200抗dystrophin和utrophin抗體4℃孵育過夜，1∶200山羊抗兔FITC-IgG孵育1h，碘化匹啶（propidine iodide，PI）反染。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡照像，并用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（Alpha，美國）進(jìn)行圖像分析，得出抗肌萎縮蛋白陽性纖維數(shù)。

1.6 Western blotting 檢測(cè)dystrophin及utrophin的表達(dá)取C57BL/6鼠、對(duì)照組mdx鼠及移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)mdx鼠腓腸肌，組織裂解液裂解組織提取蛋白，變性后調(diào)整蛋白濃度20μg/μL，上樣10μL進(jìn)行4％～7％梯度SDS-PAGE凝膠電泳，500mA恒流轉(zhuǎn)膜12～15h至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉1h；抗兔多克隆dystrophin抗體或抗山羊多克隆utrophin抗體（均以1∶600稀釋）室溫孵育1h，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或兔抗羊IgG（均為1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光劑顯色。另外制備12％分離膠做GAPDH的Western blot作為內(nèi)參對(duì)照，均以預(yù)染Marker作為分子量對(duì)照。結(jié)果用紫外線透射凝膠圖像掃描儀進(jìn)行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光法檢測(cè)L6SKM細(xì)胞移植后mdx鼠dystrophin的表達(dá)變化 抗肌萎縮蛋白抗體染色顯示，對(duì)照C57BL/6鼠肌膜呈明顯完整的網(wǎng)狀綠色熒光，PI反染示細(xì)胞核居邊；mdx鼠肌膜未見綠色熒光，大部分細(xì)胞核中移，部分居邊。經(jīng)成肌細(xì)胞L6SkM移植后2周的mdx鼠骨骼肌細(xì)胞膜無熒光顯示。而在移植后1月骨骼肌細(xì)胞膜開始出現(xiàn)少量抗肌萎縮蛋白表達(dá)，大約占細(xì)胞總數(shù)的10％，隨時(shí)間延長表達(dá)逐漸增多，2個(gè)月時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)分別占細(xì)胞總數(shù)的18％，多呈簇狀分布；3個(gè)月時(shí)進(jìn)一步增多，約為35％，經(jīng)成肌細(xì)胞L6SkM移植后mdx鼠骨骼肌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上細(xì)胞大小不一，且萎縮細(xì)胞與肥大細(xì)胞鑲嵌存在，PI反染后見細(xì)胞移植后部分細(xì)胞核邊移。

2.2 免疫熒光法檢測(cè)L6SKM細(xì)胞移植后mdx鼠utrophin表達(dá)變化 正常C57BL/6鼠utrophin主要分布于神經(jīng)肌肉接頭處，表達(dá)量較少，mdx鼠utrophin主要分布于肌膜下，與dystrophin的分布基本一致，在一些橫截面積較小的新生及纖維中表達(dá)尤為增強(qiáng)；但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)仍有少數(shù)體積較大的細(xì)胞肌膜未著色，胞漿勻染，較utrophin表達(dá)量高者著色深。經(jīng)成肌細(xì)胞L6SkM移植移植后1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月，utrophin的表達(dá)量有隨時(shí)間的延長呈逐漸減少趨勢(shì)，可見utrophin在神經(jīng)肌肉接頭處的表達(dá)。見表1。

表1 免疫熒光法檢測(cè)L6SKM細(xì)胞移植后mdx鼠dystrophin和utrophin表達(dá)變化（ˉx±s）

2.3 Dystrophin的Western blotting表達(dá) 正常對(duì)照組C57BL/6鼠及mdx鼠的蛋白表達(dá)分別為強(qiáng)陽性及陰性，經(jīng)L6SkM移植后1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月可見Dystrophin的表達(dá)呈逐漸增加趨勢(shì)，與免疫熒光結(jié)果基本一致。見圖1。

2.4 Utrophin的Western blotting表達(dá) C57BL/6鼠Utrophin的表達(dá)量較少，mdx鼠表達(dá)量較C57BL/6鼠顯著增多，經(jīng)L6SkM移植后1、2和3個(gè)月可見utrophin的表達(dá)呈逐漸減少趨勢(shì)，與免疫熒光結(jié)果基本一致。見圖2。

圖1 Western blotting檢測(cè)L6SkM移植后Dystrophin表達(dá)1：C57BL/6鼠；2：mdx鼠；3～5：經(jīng)L6SkM移植后1月、2月和3月mdx鼠

圖2 Western blotting檢測(cè)L6SkM移植后Utrophin的表達(dá)1C57BL/6鼠；2mdx鼠；3～5經(jīng)L6SkM移植后1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月mdx鼠

3 討論

成肌細(xì)胞屬于一種干細(xì)胞，具有分裂增殖的潛能，成肌細(xì)胞可以相互融合，形成終末分化的肌纖維，一般認(rèn)為其在肌原細(xì)胞譜系中處于分化進(jìn)程中的倒數(shù)第2位。骨骼肌的組織發(fā)生學(xué)表明，成肌細(xì)胞（又名生肌細(xì)胞，包括胚胎中的成肌細(xì)胞和成熟肌組中的衛(wèi)星細(xì)胞均為肌肉前體細(xì)胞）來源于中胚層干細(xì)胞，隨著胚胎的發(fā)育，肌母細(xì)胞分裂、融合而形成多核的骨骼肌纖維細(xì)胞。在肌管階段，有單個(gè)核細(xì)胞附著其表面，分化為衛(wèi)星細(xì)胞。成熟后衛(wèi)星細(xì)胞一般是靜止的，當(dāng)肌肉受損或受其他刺激時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞變?yōu)槌杉〖?xì)胞，進(jìn)行分裂并分化為肌細(xì)胞，填補(bǔ)其受損部位。

本實(shí)驗(yàn)用成肌細(xì)胞L6SkM給予mdx鼠進(jìn)行移植后2周，mdx鼠注射肢的骨骼肌細(xì)胞未檢測(cè)到有抗肌萎縮蛋白表達(dá)，而在移植后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月表達(dá)抗肌萎縮蛋白的肌纖維百分比分別為10.86％，18.45％和35.68％，說明移植后的成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為宿主的骨骼肌細(xì)胞有一個(gè)時(shí)間過程，在轉(zhuǎn)化肌纖維表達(dá)抗肌萎縮蛋白可能需要2周以上的時(shí)間，2周以后隨時(shí)間增加表達(dá)的抗肌萎縮蛋白量增高，并能穩(wěn)定地表達(dá)3個(gè)月以上。眾多學(xué)者研究抗肌萎縮蛋白表達(dá)的持續(xù)時(shí)間不一，以Law等報(bào)道的持續(xù)時(shí)間最長，1例DMD患兒細(xì)胞移植后抗肌萎縮蛋白持續(xù)達(dá)6a，認(rèn)為抗肌萎縮蛋白的表達(dá)與成肌細(xì)胞的純度、注射時(shí)的操作方法以及注射的劑量均有一定關(guān)系［6-7］。Horsley等［8］報(bào)道，通過新的信號(hào)途徑—鈣調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（calcium-regulated transcription factor）能夠調(diào)控成肌細(xì)胞與宿主細(xì)胞的融合，這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)給成肌細(xì)胞的移植研究帶來新的機(jī)遇。Smythe［9］發(fā)現(xiàn)，在MyoD裸鼠，外源的成肌細(xì)胞在移植后3個(gè)月內(nèi)遷移能力呈線性增加，而在對(duì)照的Balb/c鼠，移植后1周便停止遷移，表明MyoD缺乏能夠促進(jìn)外源成肌細(xì)胞與宿主的融合。

Radojevic等［10］還發(fā)現(xiàn)，分離正常人和貓的成肌細(xì)胞，然后分別與抗肌萎縮蛋白缺陷患者與貓的成肌細(xì)胞在一起培養(yǎng)，結(jié)果二者相互融合形成了雜交的肌管（hybrid myotube），這些雜交的肌管表達(dá)正常的抗肌萎縮蛋白、utrophin蛋白和抗肌萎縮蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（dystrophin associated protein，DAP），說明正常的抗肌萎縮蛋白基因能夠恢復(fù)成肌細(xì)胞基因的正常表達(dá)。

utrophin與dystrophin在氨基酸序列上有很大同源性，分布于全身各個(gè)組織，其中以神經(jīng)肌肉接頭處最多［11］，二者共同協(xié)同調(diào)控維持肌肉發(fā)育過程中肌肉正常的功能［12］。在DMD患者和mdx鼠utrophin表達(dá)上調(diào)可緩解因dystrophin缺失造成的傷害［13］，推測(cè)可能與胚胎時(shí)期肌肉發(fā)育過程相關(guān)，utrophin和dystrophin競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪DAP結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示mdx鼠的utrophin在肌膜上的表達(dá)明顯多于C57BL/6鼠，說明在mdx鼠的骨骼肌中確存在utrophin表達(dá)上調(diào)，且與dystrophin的表達(dá)水平基本相反，與前述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［11］。成肌細(xì)胞L6SkM移植后1月和2月時(shí)utrophin的表達(dá)有下降趨勢(shì)但不明顯，可能由于雖dystrophin的表達(dá)持續(xù)增加，但不足以彌補(bǔ)mdx鼠的骨骼肌持續(xù)進(jìn)行性變性壞死所致的utrophin表達(dá)量上調(diào)；3月時(shí)utrophin的表達(dá)有明顯下降。

成肌細(xì)胞移植肌內(nèi)注射的研究說明，移植后的外源性成肌細(xì)胞可以參與宿主的骨骼肌細(xì)胞的再生，與宿主細(xì)胞融合較長時(shí)間地表達(dá)抗肌萎縮蛋白，移植的成肌細(xì)胞達(dá)到一定的數(shù)量就可表達(dá)抗肌萎縮蛋白，是否能夠改善mdx鼠運(yùn)動(dòng)功能，還需進(jìn)一步的研究。但本實(shí)驗(yàn)所觀察到的結(jié)果至少說明這種移植方法可行。但在DMD患者中應(yīng)用仍然面臨很多需要解決的問題，如安全的成肌細(xì)胞獲取方式，安全有效的抗免疫移植劑的使用，更加優(yōu)化的能夠改善膈肌、呼吸肌功能的細(xì)胞移植途徑與方法，移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞長時(shí)、有效地融合并能夠改善患者的運(yùn)動(dòng)功能、延長壽命等。

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（收稿2014-03-14修回2014-10-07）

Effects of skeletal muscle myoblast transplantation on the dystrophin and utrophin expression in mdx rats after radiotherapy

Wang Yinlong，Shan Tieying，Pan Xiulan
The Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan056002，China

Objective To investigate the effects of skeletal muscle myoblast transplantation on the dystrophin and utrophin expression in mdx rats after radiotherapy.Methods The skeletal muscle myoblast was transplanted into mdx mice by intramuscular injection.The dystrophin and utrophin expression of limb skeletal muscle of laboratory mice were detected with immunofluorescence assay and Western blotting at 1，2and 3months after transplantation.Results The dystrophin expression level was gradually increasing but the utrophin expression level was gradually decreasing with the time extension of implantationat 1，2and 3months after transplantation.Conclusion Skeletal muscle myoblast transplantation can up-regulate the dystrophin expression level and down-regulate the utrophin expression level.

Myoblast；mdx mice；Cell transplantation；Dystrophin；Utrophin

R-332

A

1673-5110（2015）04-0004-03