基于原球莖液體培養(yǎng)的白芨快速繁殖研究

張宇思+姚正穎+劉金香+張衛(wèi)明+丁小余+孫力軍

摘要：為了建立高效的白芨快繁技術(shù)體系，研究了白芨種子萌發(fā)和原球莖生長的液體培養(yǎng)條件，比較了全程固體培養(yǎng)基培養(yǎng)（QG）與液體固體培養(yǎng)基分段培養(yǎng)（YG）這2種培養(yǎng)方式的優(yōu)劣。首先通過L18（37） 正交試驗(yàn)，篩選了適宜種子萌發(fā)及原球莖生長的液體培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，添加劑種類、大量元素、6-BA濃度、NAA濃度對白芨種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)影響最大。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)條件為1/4MS+1 mg/L NAA + 0.5 mg/L 6-BA +100 g/L馬鈴薯汁+30 g/L蔗糖，pH值 5.8，培養(yǎng)溫度為22 ℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為100 r/min，每天光照時(shí)間為8 h。另外，源于YG的白芨苗在移栽成活率、葉片顏色、葉片長度、苗高幾個(gè)方面均優(yōu)于源于QG的白芨苗，且差異顯著。本研究創(chuàng)建的液體固體培養(yǎng)基分段培養(yǎng)體系將有助于保護(hù)與可持續(xù)利用白芨野生資源。

關(guān)鍵詞：白芨；快速繁殖；分段培養(yǎng)；全程固體培養(yǎng)基；液體固體培養(yǎng)基

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0059-04

白芨[Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.]為蘭科白芨屬多年生草本植物，以塊莖供藥用，其種子極小，結(jié)構(gòu)簡單且無胚乳，自然繁殖率極低[1]。近年來，白芨的應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，加上市場需求的快速增長，野生資源遭到過度采挖，已瀕臨滅絕，現(xiàn)已被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物[2]。為了保護(hù)白芨野生資源，實(shí)現(xiàn)白芨的人工種植，逐漸有一些關(guān)于白芨組培快繁的研究，這些研究為白芨野生資源的保護(hù)與利用提供了參考。目前，雖然白芨組織培養(yǎng)和設(shè)施栽培等人工繁育關(guān)鍵技術(shù)得到了一定的發(fā)展，但是依然面臨著種苗培養(yǎng)周期長、成本高等問題。為了最大限度地縮短白芨快繁的時(shí)間，降低成本，提高白芨種苗的質(zhì)量，仍需探索更好的白芨快繁條件。

目前白芨的常規(guī)快繁方法大多以固體培養(yǎng)基為主，即將白芨種子播于固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過原球莖、無根苗、有根苗等幾個(gè)階段，最終獲得可移植到大田的白芨苗[3]。但是，利用固體培養(yǎng)基快繁白芨苗時(shí)，從組培瓶取出操作較費(fèi)工費(fèi)時(shí)，且白芨種子及原球莖在固體培養(yǎng)基上生長較慢，繁殖效率很低。為了保護(hù)與可持續(xù)利用白芨野生資源，本試驗(yàn)針對單純采用固體培養(yǎng)基的快繁技術(shù)的不足，研究利用白芨種子進(jìn)行液體和固體培養(yǎng)結(jié)合的快繁方式，以期縮短白芨快速繁殖周期，建立一種新的白芨快速繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 材料

白芨蒴果來源于安徽省宿松縣，秋分節(jié)氣前后采收，果莢飽滿，開裂或未開裂，外表無霉變，顏色為黃綠色與褐色相間，內(nèi)部種子呈分散狀。

1.2 白芨快繁操作方法

試驗(yàn)過程包括白芨種子的滅菌、原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)5個(gè)步驟，具體方法如下：

1.2.1 滅菌 對于未開裂果莢，在超凈臺中用75%乙醇將白芨蒴果消毒30 s，再用0.1%HgCl2水溶液浸泡25 min，無菌水沖洗5次，然后置于干燥的滅菌濾紙上吸盡水分，用解剖刀切開蒴果，取出種子；對于開裂果莢，在超凈臺中，將種子取出，置于兩通玻璃管中，玻璃管一端用紗布和脫脂棉封口，并用75%乙醇和1%次氯酸鈉溶液各消毒30 s和15 min，再用滅菌水灌洗3 min，最后剪開紗布，收集滅菌的種子。為了避免種子因蒴果來源不一致造成較大誤差，2種方式收集的滅菌種子合二為一。為了便于統(tǒng)計(jì)，將得到的種子用以下方式定量與接種：用滅菌水懸浮種子，種子濃度約為100粒/50 μL，用移液槍吸取種子，播于液體培養(yǎng)基中，每瓶接種 300 μL。對于固體培養(yǎng)基，用同樣的方法接種，為了讓種子在瓊脂培養(yǎng)基上分散，在接種后多加200 μL滅菌水，以便沖散可能聚集的種子。

1.2.2 原球莖在液體培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將種子接種到液體培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)原球莖生長。設(shè)計(jì)L18（37）正交試驗(yàn)，對液體培養(yǎng)基配方中的7個(gè)因素，包括大量元素濃度、NAA濃度、6-BA濃度、添加劑種類、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、光照時(shí)間等進(jìn)行培養(yǎng)條件篩選。篩選試驗(yàn)的因素水平見表1。其中，添加劑含量為100 g/L，光照度為2 500 lx。將白芨種子接種各配方培養(yǎng)基后，跟蹤觀察種子萌發(fā)時(shí)間，測定原球莖生長速度。規(guī)定20%種子萌發(fā)（吐綠）作為萌發(fā)時(shí)間的記錄點(diǎn)。接種20 d后（每種處理的種子萌發(fā)率均已達(dá)97%以上），隨機(jī)選取50粒原球莖，測定其直徑。因?yàn)橛盟♂尫ń臃N的種子數(shù)并不完全一致，因此，隨機(jī)選取500粒已測直徑的原球莖，在65 ℃環(huán)境中烘干，稱干質(zhì)量。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值；測量原球莖直徑時(shí)，對于每個(gè)處理，所取原球莖數(shù)量大于50粒。

1.2.3 分化培養(yǎng) 將各配方培養(yǎng)所得的原球莖（包括來源于固體培養(yǎng)基的原球莖）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，溫度25 ℃，相對濕度55%～75%，光照度2500 lx，光照周期為10 h/14 h，進(jìn)行分化培養(yǎng)。隨后將溫度調(diào)整為夜溫22 ℃，日溫25 ℃，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將白芨小苗從壯苗培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根的分化。培養(yǎng)條件為夜溫22 ℃，日溫25 ℃，相對濕度55%～75%，光照度3000 lx，每天光照10 h。然后將快繁苗置于遮陰度為80%的大棚中，在瓶中培養(yǎng)3 d后打開瓶蓋，再培養(yǎng)3 d，小心取出白芨苗，洗凈根上黏附的瓊脂，移栽至配好的基質(zhì)中。培養(yǎng)1個(gè)月以后，觀察生長狀況。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

記錄白芨種子萌發(fā)時(shí)間，利用游標(biāo)卡尺測量原球莖的直徑，稱量原球莖干質(zhì)量，并對原球莖的直觀生長狀況進(jìn)行描述。利用SPSS 13.0對每次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)主要因素對種子萌發(fā)時(shí)間與原球莖生長速度的影響

本試驗(yàn)規(guī)定，20%種子萌發(fā)即為種子萌發(fā)時(shí)間記錄點(diǎn)。從圖1可以看出，萌發(fā)的種子呈現(xiàn)淺綠色。隨著萌發(fā)種子數(shù)量的增多，原球莖已形成。20 d后，迅速生長中的原球莖已呈現(xiàn)深綠色。根據(jù)白芨及蘭科其他植物種子培養(yǎng)條件的相關(guān)文獻(xiàn)，選擇大量元素濃度、NAA濃度、6-BA濃度、添加劑種類、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、光照時(shí)間等7個(gè)因素作為篩選培養(yǎng)條件的考察對象，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。18號處理組的種子1周后便開始萌發(fā)，而3號和10號處理在12 d左右時(shí)才開始萌發(fā)。與此對應(yīng)的是，18號處理組的原球莖直徑為 2.69 mm，且顏色均一，呈現(xiàn)濃綠色（圖2-A）；3號（圖2-D）和10號處理的原球莖直徑僅為1.11 mm和1.23 mm，顏色不均一，許多呈現(xiàn)淺黃色。同時(shí)，18號處理的500粒原球莖干質(zhì)量約0.522 g，而11號和10號處理的原球莖干質(zhì)量僅為0.090 g和0.095 g（3號為0.099 g）。1號（圖2-C）和16號（圖2-B）原球莖直徑相當(dāng)，分別為1.60 mm和1.61 mm，顏色也較均一，優(yōu)于3號，劣于18號。

對白芨種子萌發(fā)時(shí)間數(shù)據(jù)作極差分析，結(jié)果（表3）顯示，7個(gè)因素的極差值分別為2.283、0.916、0.633、2.284、0.500、0.617、0.300 d。其中大量元素、添加劑種類極差值較大。由于影響因素不同水平的極差大小與該因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度呈正相關(guān)，因此由極差可以推斷，對種子萌發(fā)影響的主次程度為添加劑種類>大量元素>NAA濃度>6-BA濃度>搖床轉(zhuǎn)數(shù)>溫度>光照時(shí)間。對原球莖直徑數(shù)據(jù)作極差分析，結(jié)果表明，4個(gè)因素的極差較大，分別為0.600、0.266、

0.324 、0.526 mm，可推測對原球莖直徑影響的主次程度為大量元素>添加劑種類>6-BA濃度>NAA濃度。然而，對500粒原球莖干質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析顯示，影響因素主次程度卻為添加劑種類>大量元素>NAA濃度>6-BA濃度（極差分別為0179、0.131、0.091、0.080 g）。

對種子萌發(fā)時(shí)間、原球莖直徑、原球莖干質(zhì)量的數(shù)據(jù)作方差分析（表4）可知，添加劑種類、大量元素對種子萌發(fā)時(shí)間、原球莖直徑、干質(zhì)量的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），與極差分析結(jié)果一致。值得注意的是，添加劑種類、大量元素對原球莖直徑的影響達(dá)到極顯著水平（P<001），添加劑種類對原球莖干質(zhì)量的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

綜上所述，在本試驗(yàn)中預(yù)選的7個(gè)影響因素中，添加劑種類、大量元素對白芨種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)影響最大，其次為6-BA濃度、NAA濃度。以上述數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)可推測，在本研究中，白芨種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為液體1/4MS+

1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100 g/L馬鈴薯汁+30 g/L 蔗糖，pH值5.8，培養(yǎng)溫度為22 ℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 100 r/min，每天光照時(shí)間為8 h。

2.2 2種培養(yǎng)方法對白芨快繁苗質(zhì)量的影響

液體固體培養(yǎng)基分段培養(yǎng)（YG）即是原球莖階段在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，從原球莖分化到生根過程則在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行；而全程固體培養(yǎng)基培養(yǎng)（QG）則是整個(gè)過程均在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基配方、后續(xù)移栽煉苗過程均與分段培養(yǎng)一致。2種培養(yǎng)方法種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件均為液體1/4MS+ 1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100 g/L馬鈴薯汁+30 g/L蔗糖，pH值5.8，培養(yǎng)溫度為 22 ℃，每天光照時(shí)間為8 h。結(jié)果表明，2種方法培養(yǎng)的白芨苗在移栽1個(gè)月后的生長狀況差異明顯。源于YG的白芨苗移栽成活率為98.33%，而源于QG的成活率僅為80.53%，差異顯著（P<0.05，表5）。

3 結(jié)論與討論

3.1 大量元素對白芨種子萌發(fā)及原球莖生長的影響

MS是植物組培中常用的一種培養(yǎng)基，因其營養(yǎng)成分豐富，各元素比例適中，在植物的胚、原球莖、莖段等組培中得到了廣泛應(yīng)用[4-8]，而且液體MS培養(yǎng)基同樣適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)[9-12]。MS培養(yǎng)基中大量元素的濃度，對植物組培有顯著影響。景維杰等研究表明，當(dāng)大量元素?zé)o機(jī)鹽濃度調(diào)整為1/5時(shí)，更有利于蝴蝶蘭莖尖生長點(diǎn)的生長；在一定濃度范圍內(nèi)，提高硝酸態(tài)氮的比例，或者提高鉀離子濃度，均對蝴蝶蘭莖尖生長點(diǎn)培養(yǎng)有利[13]。除了蘭科植物，大量元素濃度的改變對其他植物組培也有影響，如大量元素中鈣鹽濃度不變，其余元素濃度降低為2/3，再與激素配合，均可以促進(jìn)山桐子愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的分化和增殖等[14]。

本研究采用MS基本培養(yǎng)基，篩選試驗(yàn)了多個(gè)濃度的大量元素對白芨種子萌發(fā)及原球莖生長的影響，結(jié)果顯示大量元素濃度的改變對白芨種子萌發(fā)時(shí)間、原球莖直徑、原球莖干質(zhì)量影響顯著，且1/4MS培養(yǎng)基效果最佳。無獨(dú)有偶，劉曉燕等報(bào)道，與白芨同為蘭科植物的蝴蝶蘭原球莖增殖速度隨著MS培養(yǎng)基中大量元素濃度的升高而降低，即降低大量元素濃度促進(jìn)了白色花系蝴蝶蘭原球莖的增殖[15]。然而，大量元素濃度影響植物組培效果的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

3.2 外源植物激素及復(fù)合性營養(yǎng)物質(zhì)對白芨種子萌發(fā)及原球莖生長的影響

植物激素對植物生長發(fā)育的巨大調(diào)節(jié)作用毋庸置疑，細(xì)胞分裂素與生長素的相互作用及其濃度比例決定了植物組織的發(fā)育方向——分化或脫分化[16-17]。在本研究中，外源添加的NAA和6-BA的濃度對種子的萌發(fā)與原球莖生長發(fā)揮了重要作用，且作用顯著。然而，在未添加外源NAA及6-BA時(shí)，原球莖干質(zhì)量也能達(dá)到所有處理組的中等水平。這可能是因?yàn)閮?nèi)源的生長素及細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)度高于外源添加激素的作用。

已有多個(gè)研究證明，外源添加一些復(fù)合性營養(yǎng)物質(zhì)，如馬鈴薯汁、香蕉汁、椰子汁等，可以促進(jìn)種子萌發(fā)及原球莖的生長發(fā)育[18-20]。本研究結(jié)果顯示，外源添加物質(zhì)對白芨種子萌發(fā)時(shí)間和原球莖生長有很大影響，在考察的7個(gè)因素中，外源添加物質(zhì)的影響程度最大。外源添加的復(fù)合營養(yǎng)物質(zhì)對原球莖直徑及原球莖干質(zhì)量影響極顯著。有研究表明，椰子汁可以促進(jìn)白色花系蝴蝶蘭原球莖的增殖[15]。然而，本研究結(jié)果表明，蝴蝶蘭與白芨雖同為蘭科植物，但馬鈴薯汁更有利于白芨種子的萌發(fā)及原球莖的生長。這同謝玲玲等的研究結(jié)果相似，即添加了馬鈴薯的KC培養(yǎng)基上，白芨種子的發(fā)芽率最高[21]?？傊庠磸?fù)合性營養(yǎng)物質(zhì)在植物組培中的積極作用被越來越多地研究證明，但是不同營養(yǎng)物質(zhì)對哪些植物組培有影響，具體是哪些成分在起作用，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 培養(yǎng)方式對白芨快繁的影響

在植物組培過程中，最常用的是固體培養(yǎng)基；而在某些植物培養(yǎng)過程中，采用液體培養(yǎng)有著固體培養(yǎng)基不可比擬的優(yōu)勢。例如，在液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)的大花蕙蘭原球莖質(zhì)量顯著優(yōu)于源于固體培養(yǎng)基的原球莖質(zhì)量，其增殖系數(shù)和鮮質(zhì)量明顯提高[22]。Zuraida等在研究以液體振蕩培養(yǎng)方式培養(yǎng)菠蘿幼芽時(shí)發(fā)現(xiàn)，菠蘿幼芽在液體培養(yǎng)基中的增殖速度是在固體培養(yǎng)基上的9倍[23]。然而，在現(xiàn)有的報(bào)道中還很少有采用液體培養(yǎng)白芨種子及原球莖的研究，本研究通過第1階段的液體振蕩培養(yǎng)和第2階段的固體培養(yǎng)，以求克服全程固體培養(yǎng)的弊端，在培養(yǎng)過程中，種子和原球莖能充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)，吸收營養(yǎng)、代謝快，加快了種子萌發(fā)和原球莖生長發(fā)育速度，最終提高了白芨種子萌發(fā)率，也提高了原球莖的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。這些優(yōu)勢最終體現(xiàn)在了白芨快繁苗的質(zhì)量上。此外，將原球莖從組培瓶取出放置在分化培養(yǎng)基上時(shí)，操作省時(shí)省力，大大減少了工作量。

值得一提的是，在用這2種培養(yǎng)方式培養(yǎng)蘭科植物種子及原球莖時(shí)，在培養(yǎng)基單位體積內(nèi)種子數(shù)量、原球莖數(shù)量與種子萌發(fā)速率和原球莖的生長速率也有關(guān)系[24-26]。本試驗(yàn)采用定量接種，使得每個(gè)處理的液體培養(yǎng)基中單位體積內(nèi)的種子數(shù)量基本保持一致，最大程度地降低了因接種密度不同所導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差。這種接種方法同樣也適用于蘭科其他植物種子萌發(fā)與原球莖生長研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張建霞，付志惠，李洪林，等. 白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關(guān)系[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（4）：32-35.

[2]中國重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄[EB/OL]. [2014-10-01]. http： //www.plant.csdb.cn/protectlist.

[3]管常東，葉 靜，鄭曉君，等. 白芨組織快繁育苗技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，32（增刊1）：416-421.

[4]侯大強(qiáng)，柴明良，莊曉英. 長期離體培養(yǎng)的春石斛蘭類原球莖生長及生根條件的優(yōu)化[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，20（5）：392-394，397.

[5]Asrandina S S，Tashimbayeva A，Mamutova A，et al. Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni in Kazakhstan[J]. Current Opinion in Biotechnology，2013，24：S125.

[6]Berhanu R，F(xiàn)eyissa T. Factors affecting in vitro propagation of cassava （Manihot esculenta Crantz.） Euphorbiaceae，varieties of ‘Kelloand ‘Qulle[J]. Ethiopian Journal of Biological Sciences，2013，12（1）： 25-39.

[7]Fernández Suárez K，F(xiàn)ernández Martín F，Declerck S. Searching of a new culture medium for in vitro mycorrhization of potato （Solanum tuberosum L.） plantlets[J]. Cultivos Tropicales，2013，34（4）： 9-19.

[8]Vinterhalter B，Miloevi c' D K，Jankovi c' T，et al. In vitro propagation of Gentiana dinarica Beck[J]. Central European Journal of Biology，2012，7（4）：690-697.

[9]Abdi F，Mehrabi A A，Zarei B. Optimization of cell suspension culture in different genotypes of Allium rotundum L.[J]. International Journal of Biosciences ，2014，4（11）：138-143.

[10]Lee P L，Chen J T. Plant regeneration via callus culture and subsequent in vitro flowering of Dendrobium huoshanense[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2014，36（10）：2619-2625.

[11]張玉瓊，陳 娜，周建輝，等. 石蒜懸浮細(xì)胞系的建立及其生物堿累積的研究[J]. 中草藥，2013，44（24）：3540-3545.

[12]張守英，闕國寧. 晚松懸浮細(xì)胞系的建立和原生質(zhì)體的分離[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2002，15（2）：247-251.

[13]景維杰，黃容清，蔣明殿，等. 蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)脫病毒技術(shù)初步研究[J]. 中國園藝文摘，2013，29（4）：13-16.

[14]李緒友，汪焱軍，王海東，等. 山桐子幼根離體培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，20（3）：22-23.

[15]劉曉燕，向青云，劉玲玲，等. 基本培養(yǎng)基及附加物對蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響[J]. 種子，2005，24（6）：18-20，26.

[16]Su Y H，Liu Y B，Zhang X S. Auxin-cytokinin interaction regulates meristem development[J]. Molecular Plant，2011，4（4）：616-625.

[17]Della Rovere F，F(xiàn)attorini L，DAngeli S，et al. Auxin and cytokinin control formation of the quiescent centre in the adventitious root apex of Arabidopsis[J]. Annals of Botany，2013，112（7）：1395-1407.

[18]Chen W H，Kao Y L，Tang C Y. Method for producing polyploid plants of orchids： U.S. Patent 8383881[P]. 2013-02-26.

[19]Ng C Y，Saleh N M. In vitro propagation of Paphiopedilum orchid through formation of protocorm-like bodies[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture ，2011，105（2）：193-202.

[20]Zhao D，Hu G，Chen Z，et al. Micropropagation and in vitro flowering of Dendrobium wangliangii： A critically endangered medicinal orchid[J]. Journal of Medicinal Plants Research，2013，7（28）： 2098-2110.

[21]謝玲玲，趙青華. 白及種子無菌繁殖微型種莖初探[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（19）：4708-4709.

[22]李 旭，樸炫春，楊金鳳，等. 大花蕙蘭原球莖增殖影響因素的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：54-55.

[23]Zuraida A R，Shahnadz N A，Harteeni A，et al. A novel approach for rapid micropropagation of maspine pineapple （Ananas comosus L.） shoots using liquid shake culture system[J]. African Journal of Biotechnology，2011，10（19）：3859-3866.

[24]李 旭，樸炫春，邵春繪，等. 接種密度、培養(yǎng)基中蔗糖和活性炭濃度對生物反應(yīng)器內(nèi)大花蕙蘭原球莖增殖的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（5）：1-3.

[25]楊麗娟. 大花蕙蘭離體快繁關(guān)鍵技術(shù)及多倍體誘變研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[26]張 艷，錢忠英，陳軍峰，等. 影響霍山石斛原球莖生長的若干因素[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，38（4）：408-413. 李 娟，申軍艷，陳 楓，等. 2種乙烯抑制劑對連作地黃生長的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：332-335.