阮玲云，蘇達龍，單書凱，李 哲，李釗鋒，胡開輝，孫淑靜

（福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002）

不同條件對銀耳芽孢及其多糖產量影響*

阮玲云，蘇達龍，單書凱，李 哲，李釗鋒，胡開輝，孫淑靜**

（福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002）

銀耳芽孢不僅可作為新型生物反應器生產外源藥用蛋白，其多糖也具有重要藥用價值，通過測定不同pH值、氮源、碳源、無機鹽及營養(yǎng)饑餓等條件下銀耳芽孢及胞內外多糖產量，探索各營養(yǎng)條件對銀耳芽孢、多糖產量及分泌多糖能力的影響。結果表明，最適初始pH為5，碳源為麥芽糖，氮源為NaNO3，銀耳芽孢和胞內外總多糖產量最高，與其它相同條件比較達到顯著性差異，在以上單因素變化中，芽孢最高產量13.8 g/100mL，總多糖最高產量為145.31 mg/100mL。但蔗糖及NH4Cl有利于胞外多糖的產生。不同培養(yǎng)基成分實驗結果表明，低氮及高無機鹽不僅有利于芽孢的生長及多糖的產生，而且有利于多糖的分泌。

銀耳芽孢；發(fā)酵；營養(yǎng)條件；多糖

銀耳（Tremella fuciformis Berk.） 又稱白木耳，在真菌分類學中，屬于真菌門（Eumycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、有隔擔子菌亞綱（Heterobasidiomycetes）、銀耳目（Tremellales）、銀耳科（Tremel－laceae）、銀耳屬（Tremella）[1]。自古以來，銀耳都被視為滋補食品。研究表明，銀耳的主要藥用成分是多糖，銀耳多糖是從銀耳子實體或芽孢中以熱水浸提、酶提取法、堿浸提法及酶解提取法等[2-4]方法獲得的活性多糖類物質，為擔子菌多糖類免疫增強劑。眾多研究結果表明，銀耳多糖具有提高人體免疫功能、強心、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化等藥理作用[5]，是一種較理想的滋補強壯劑。同時銀耳芽孢多糖具有淬滅致病細菌群體感應的功能[6]。銀耳多糖因其眾多的保健作用日益受到各國人民的青睞，若僅靠子實體來提取顯然速度不夠，此時通過液體深層發(fā)酵技術進行大規(guī)模快速發(fā)酵生產多糖的銀耳芽孢就顯示出明顯的優(yōu)勢[7-8]。胞外多糖（EPS）的產量受諸多因素影響，除與菌種的遺傳特性有關，菌株培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和環(huán)境條件也會影響銀耳芽孢多糖的合成。研究表明，pH、發(fā)酵方式、葡萄糖的添加等因素顯著影響銀耳芽孢生物量及胞外多糖產量[9-1 2]，因此，探索各可控條件對銀耳芽孢及胞外多糖產量的影響，對提高銀耳附加值及銀耳多糖規(guī)?；a具有重要意義，但營養(yǎng)缺乏及無機鹽等條件對銀耳芽孢產量及多糖分泌能力的影響未見報道。本實驗通過不同營養(yǎng)條件對銀耳芽孢產量及胞內外多糖產量影響的研究，為銀耳芽孢改變營養(yǎng)條件調節(jié)芽孢產量、多糖產量以及作為生物反應器胞外物質分泌能力提供理論依據，同時對芽孢高效生產多糖、降低生產成本具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1材料

銀耳芽孢菌株，由福建農林大學生命科學學院微生物工程實驗室提供。

1.2儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；JY92-11D超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；智能型生化培養(yǎng)箱（SPX），上海博訊實業(yè)有限公司；大容量雙層全溫搖床（QYC-2102），寧波江南儀器廠。

1.3供試培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

完全培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g、蛋白胨 2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，水1 000 mL，pH自然。

低氮培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖15.0 g、硝酸銨0.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

吐溫20培養(yǎng)基（1 L）：在低氮培養(yǎng)基中加5.0 g，吐溫20，pH自然。

高氮低碳培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖0.5 g、蛋白胨2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

高無機鹽培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖15.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO42 g，pH自然。

低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

1.4方法

1.4.1 不同pH對銀耳芽孢及多糖產量的影響

用HCl溶液和NaOH溶液將完全培養(yǎng)基pH值調至3、5、7、9四個梯度，取1 mL芽孢發(fā)酵液分別接種于裝100 mL液體培養(yǎng)基三角瓶中，以未調pH值的完全培養(yǎng)基為對照，每個梯度3個重復。25℃、110 r·min-1的搖床中培養(yǎng)4 d。8 000 r·min-1離心10 min，分別收集上清液和銀耳芽孢，芽孢用等體積的無菌水重復清洗3次，60℃烘至恒重,測芽孢產量。

1.4.2 不同碳源對銀耳芽孢及多糖產量的影響

以完全培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將其葡萄糖分別換成1.5%的蔗糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，起始pH為以上優(yōu)化結果。取1 mL芽孢發(fā)酵液分別接種于裝100 mL液體培養(yǎng)基三角瓶中，每個梯度3個重復。25℃、110 r·min-1的搖床中培養(yǎng)4 d，具體操作同上。

1.4.3 不同氮源對對銀耳芽孢及多糖產量的影響

將完全培養(yǎng)基的氮源分別換成NH4Cl、NaNO3、尿素、NH4NO3，起始pH為以上優(yōu)化結果，取1 mL芽孢發(fā)酵液分別接種于裝100 mL液體培養(yǎng)基三角瓶中，具體操作同上。

1.4.4 不同營養(yǎng)條件對銀耳芽孢及多糖產量的影響

取1 mL芽孢發(fā)酵液分別接種于完全培養(yǎng)基、低氮培養(yǎng)基、吐溫20培養(yǎng)基、高氮低碳培養(yǎng)基、高無機鹽培養(yǎng)基、低氮低碳低無機鹽培養(yǎng)基（三低培養(yǎng)基）中，測芽孢重量及其多糖產量，具體操作同上。

1.4.5 胞內外多糖的提取及含量測定

取10 mL收集的上清液于50 mL離心管，加入3倍體積的無水乙醇，充分混勻后置于4℃冰箱過夜。第2天取出4℃、8 000 r·min-1離心10 min后棄上清，收集沉淀。準確稱取3 g芽孢于50 mL離心管加入無菌水至20 mL，置于冰水浴中采用超聲破碎（功率300 W，“1/2”探頭，破碎3 s、間歇3 s，共破碎10 min）。將破碎液置于60℃水浴鍋中水浴4 h后，4℃、8 000 r·min-1離心10 min。取上清液，加入3倍體積的無水乙醇，充分混勻后置于4℃冰箱過夜。第2天取出4℃，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集沉淀，苯酚-硫酸法[13]測胞內外沉淀多糖含量。總多糖為胞外多糖和胞內多糖之和。

1.4.6 數據處理

數據采用DPS7.05軟件進行單因素統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1不同pH對銀耳芽孢及多糖產量的影響

未調pH值的完全培養(yǎng)基芽孢的產量為6.89 g/100mL，胞內多糖含量為20.34 mg/100mL，總多糖含量為24.64 mg/100mL。不同pH下芽孢和多糖產量測定結果見圖1。

圖1 起始pH值對銀耳芽孢及多糖產量的影響Fig.1 Effect of different pH value on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由圖1可知，pH對銀耳芽孢產量和胞內外多糖產量有顯著的影響。在pH為3時，芽孢生長受到較明顯的抑制，胞內外多糖產量也極少。隨著pH的升高，銀耳芽孢生長都較好，胞內外多糖產量也明顯增加。在pH為5時，銀耳芽孢生長狀況最好，芽孢產量和胞外多糖產量最高，分別為7.69 g/100mL和6.89 mg/100mL，與其它pH值的芽孢產量和胞外多糖產量相比達到顯著性差異，這說明強酸和強堿條件均不利于銀耳芽孢的生長及多糖的產生。

2.2不同碳源對銀耳芽孢及多糖產量的影響

培養(yǎng)基的碳源主要用來供應生物體生命活動所需的能量，是構成細胞以及代謝產物的物質基礎。本實驗分別用麥芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖代替完全培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量為1.5%，培養(yǎng)基其它成分和配比不變，探究了不同碳源對銀耳芽孢及多糖產量的影響，實驗結果見圖2。

圖2 不同碳源對銀耳芽孢及多糖產量的影響Fig.2 Effect of different carbon source on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

在二糖中，當以麥芽糖作為碳源時，銀耳芽孢產量最高，為13.8 g/100mL，所產胞內多糖產量也最高，119.41 mg/100mL，總多糖產量為 145.31 mg/100mL，與完全培養(yǎng)基及其它碳源條件培養(yǎng)的銀耳芽孢和胞外多糖產量相比達到顯著性差異。芽孢也能較好的利用蔗糖并能促進胞外多糖的分泌，蔗糖作為碳源，胞外多糖含量是麥芽糖的1.6倍。以乳糖作為碳源時，芽孢生長及胞內外多糖產量均明顯處于劣勢。這可能是由于在用乳糖作為碳源培養(yǎng)時，銀耳芽孢無法吸收而影響了銀耳芽孢的生長，從而導致胞內外多糖產量較低。

2.3不同氮源對對銀耳芽孢及多糖產量的影響

銀耳芽孢對氮源種類的要求嚴格，蛋白胨是蛋白質經酶、酸、堿水解而獲得的一種多肽、氨基酸組成的水溶性混合物，它作為有機氮源由于成分復雜，所包含含氮類物質比較多，芽孢長勢相對會比較好。本實驗分別以NH4Cl、NaNO3、尿素、NH4NO3為氮源，比較芽孢及胞內外多糖產量，結果見圖3。

圖3 不同氮源對銀耳芽孢及多糖產量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由圖3可以看出，氮源為NaNO3時，銀耳芽孢產量最高，總多糖產量也最高，達80.36 mg/100mL，但胞外多糖產量很低，與其它氮源培養(yǎng)胞外多糖產量相比有顯著性差異，說明NaNO3并不利于胞外多糖的分泌。以氯化銨為氮源時，胞外多糖產量較高。尿素和硝酸銨作為氮源時，對銀耳芽孢產量影響顯著，胞內多糖及總多糖產量相對都較低。

2.4不同營養(yǎng)條件對銀耳芽孢及多糖產量的影響

碳源和氮源對銀耳芽孢的生長及代謝影響較大，無機鹽在芽孢代謝過程中也起到了重要的作用。本實驗測試了5種不同培養(yǎng)基（低氮、低氮+吐溫20、高氮低碳、高無機鹽、三低）對銀耳芽孢及多糖產量的影響，實驗結果見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)基對銀耳芽孢及多糖產量影響Fig.4 Effect of different media on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由圖4可以看出，高無機鹽培養(yǎng)基中銀耳芽孢產量最高，胞外多糖產量達113.16 mg/100mL，與其它條件銀耳芽孢培養(yǎng)胞外多糖產量相比有顯著性差異。低氮條件次之，其他3種條件下銀耳芽孢產量幾乎為零，多糖產量也較低。在碳源正常的情況下，低氮及高無機鹽有利于銀耳芽孢的生長、多糖的產生及胞外多糖的分泌。

3 結論與討論

本文通過測定不同pH值、氮源、碳源、無機鹽及營養(yǎng)饑餓等條件下銀耳芽孢及胞內外多糖產量，探索各營養(yǎng)條件對銀耳芽孢、多糖產量及分泌多糖能力的影響。結果表明最適初始pH為5時有利于銀耳芽孢的產生以及胞外多糖的分泌，碳源為麥芽糖時有利于銀耳芽孢的產生及總多糖產量的提高，但不利于胞外多糖的產生，氮源為NaNO3時銀耳芽孢和胞內外總多糖產量最高，但胞外多糖產量低，蔗糖及NH4Cl有利于胞外多糖的產生。不同培養(yǎng)基成分實驗結果表明，低氮及高無機鹽不僅有利于芽孢的生長及多糖的產生，并能增強胞外多糖的分泌。以上研究結果雖然胞外多糖與朱虎等[11]報道最高產量5.8 g·L-1相差很大，但本研究結果對提高銀耳附加值、胞外物質分泌能力及降低生產成本具有重要實際應用價值。

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Effects of Different Conditions on the Yield of Polysaccharides and Spores from Tremella fuciformis

RUAN Ling-yun,SU Da-long,SHAN Shu-kai,LI Zhe,LI Zhao-feng,HU Kai-hui,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Tremella fuciformis spores were used as new type bioreactor to produce foreign medical protein.At the same time the polysaccharides of T.fuciformis spores had many medical functions for human.The yields of spores and polysaccharides of T.fuciformis were determined under different conditions including different pH value,nitrogen sources,carbon sources and other medium components for exploring the effects of all kinds of conditions on the yields of spores and polysaccharides.The results showed the optimum pH,carbon and nitrogen sources for producing the maximum polysaccharide yield were respectively pH 5, maltose and NaNO3.Among the change of single factor,the yields of spores and polysaccharides were highest respectively 13.8 g/ 100mL and 145.31 mg/100mL.The production of exopolysaccharides (EPS)was higher using sucrose as carbon source and NH4Cl as nitrogen source.The low nitrogen content and high inorganic salts content were to benefit of spores production and polysaccharides,especially the production of EPS.

Tremella fuciformis;fermentation;nutritional condition;polysaccharide

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0047-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.012

福建省發(fā)改委農業(yè)五新工程項目，項目編號：閩發(fā)改委投資 [2012]931號；福建省自然基金杰出青年項目，項目編號：2014J06010；福建農林大學校杰出青年人才項目項目，編號：xjq201209；國家自然基金青年項目，項目編號：31201669；教育部博士點基金，項目編號：20103515120015。

阮玲云（1989－）女，在讀碩士研究生，研究方向：食用真菌學。E－mail:rly2014@126.com

**通信作者：孫淑靜（1978－），女，博士，副教授，主要從事食用真菌學方面研究。E－mail:shjsun2004@126.com

2015－03－10