徐龍?chǎng)危幸皂?，朱麗莉，伍革?/p>

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng)550005）

瑤山雞MTNR1B基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析

徐龍?chǎng)?，尚以?，朱麗莉，伍革民

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng)550005）

本研究擬為貴州優(yōu)質(zhì)品種資源瑤山雞的高產(chǎn)選育提供科學(xué)依據(jù)。運(yùn)用分子生物學(xué)手段，設(shè)計(jì)2對(duì)引物P1、P2采用單核苷酸多態(tài)性和測(cè)序相結(jié)合的方法，研究瑤山雞MTNR1B基因的遺傳多樣性，并與產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：P1檢測(cè)出AA、AC、BC 3種基因型，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因A的頻率最高為0.90，多態(tài)信息含量為0.17，P1位點(diǎn)的3種基因型與開(kāi)產(chǎn)日齡和38周齡產(chǎn)蛋數(shù)差異均不顯著；P2檢測(cè)出AA、AB、AC、AD 4種基因型，AC為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因A的頻率最高為0.51，多態(tài)信息含量為0.46，AD和AC基因型的開(kāi)產(chǎn)日齡顯著高于AA和AB基因型（P＜0.05），AA和AD基因型的產(chǎn)蛋數(shù)極顯著高于AB基因型（P＜0.01），AC基因型的產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于AB基因型（P＜0.05）。

瑤山雞；MTNR1B基因；遺傳多態(tài)性；產(chǎn)蛋性狀

褪焦激素(Melatonin,MEL)主要是由鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的松果體分泌的一種重要的內(nèi)分泌激素,視網(wǎng)膜和內(nèi)臟器宮也有少量的分泌［1-2］。MEL可以通過(guò)調(diào)控促性腺激素、甲狀腺激素和生長(zhǎng)激素等神經(jīng)內(nèi)分泌作用,調(diào)教鳥(niǎo)類(lèi)的繁殖、體溫、新陳代謝、睡眠、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等生理活動(dòng)［3-7］。國(guó)內(nèi)的一些研究表明,通過(guò)主動(dòng)免疫降低蛋雞血液中MEL水平,可顯著提高血液中雌二醇的水平,進(jìn)而提高蛋雞的產(chǎn)蛋量［8-9］。

由于MEL對(duì)家禽等鳥(niǎo)類(lèi)繁殖活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)作用,將MEL受體基因作為影響雞的早熟性和產(chǎn)蛋量等繁殖性狀的候選基因進(jìn)行研究具有重要的意義。目前,關(guān)于MEL受體基因多態(tài)性及其與雞產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析的研究報(bào)道,僅見(jiàn)于壽光雞MTNR1A基因的多態(tài)性［10］和文昌雞MTNR1B基因的多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)系研究［11］。本研究以貴州地方優(yōu)良品種瑤山雞為研究對(duì)象,通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段,研究褪焦激素受體基因MTNR1B的單核苷酸多態(tài)性,并分析其與開(kāi)產(chǎn)日齡和38周齡產(chǎn)蛋數(shù)的關(guān)聯(lián)性,旨在從分子水平上了解瑤山雞MTNR1B基因?qū)Ξa(chǎn)蛋性狀的影響機(jī)理,為瑤山雞產(chǎn)蛋性能的遺傳改良提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群實(shí)驗(yàn)材料選自貴州省貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村荔波瑤山雞種雞場(chǎng)F3代205只母雞,群體一致性較好,性能較穩(wěn)定。采用常規(guī)飼養(yǎng)管理方式,個(gè)體籠養(yǎng)。測(cè)定個(gè)體的開(kāi)產(chǎn)日齡、38周齡產(chǎn)蛋數(shù)等產(chǎn)蛋性狀。使用一次性肝素鈉抗凝采血管采取翅下靜脈血樣1～1.5 mL,冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。

1.2 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據(jù)GenBank上發(fā)表的雞MTNR1B基因的DNA序列(NC-006088.2)應(yīng)用Primier 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物P1、P2,引物信息如表1所示。引物由上海生物工程公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增及聚丙烯凝膠電泳PCR反應(yīng)為20 μL。DNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,2×Taq PCR MasterMix試劑10 μL,加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)(35循環(huán))：95℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸45 s；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物變性10 min,迅速放于冰塊上,取10 μL PCR產(chǎn)物上樣于12%的非變性PAGE膠,1×TBE作緩沖液,電壓250 V,電泳4 h,銀染顯色。

1.4 基因分型及多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)銀染顯色后,對(duì)條帶進(jìn)行分型,對(duì)不同的基因型進(jìn)行記錄,再次PCR擴(kuò)增后,檢測(cè)效果良好,送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析用Genetics軟件計(jì)算MTNR1B基因的基因型頻率、等位基因頻率和多態(tài)信息含量。統(tǒng)計(jì)每只雞的開(kāi)產(chǎn)日齡以及開(kāi)產(chǎn)至38周齡的產(chǎn)蛋數(shù),對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的基因型分別與開(kāi)產(chǎn)日齡和38周齡產(chǎn)蛋數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。利用SPSS18.0軟件,采用單因子方差分析方法分析基因型與早期產(chǎn)蛋性狀的關(guān)系。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 MTNR1B基因型檢測(cè)結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果表明MTNR1B基因PCR產(chǎn)物片段大小與設(shè)計(jì)的片段大小一致。經(jīng)過(guò)聚丙烯酸胺電泳檢測(cè)MTNR1B基因型,結(jié)果表明,P1位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AC、BC 3種基因型(圖1),其中170個(gè)樣本表現(xiàn)出AA基因型,為優(yōu)勢(shì)基因型；P2位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AB、AC、AD 4種基因型(圖2),其中AC基因型172個(gè),為優(yōu)勢(shì)基因型。

圖1 P1的PAGE分型結(jié)果

圖2 P2的PAGE分型結(jié)果

2.2 MTNR1B基因的遺傳多樣性MTNR1B基因的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果如表2所示。

表2 MTNR1 B基因的遺傳多態(tài)性

2.3 MTNR1B基因多態(tài)與瑤山雞的開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)關(guān)聯(lián)分析MTNR1B基因的基因型與瑤山雞的開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明,P1位點(diǎn)的3種基因型與開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)差異均不顯著；P2位點(diǎn)中AD和AC基因型的開(kāi)產(chǎn)日齡顯著高于AA和AB基因型(P＜0.05),AA和AD基因型的產(chǎn)蛋數(shù)極顯著高于AB基因型(P＜0.01),AC基因型的產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于AB基因型(P＜0.05)。

表3 MTNR1B基因的基因型與瑤山雞的開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)關(guān)聯(lián)分析

3 討論與結(jié)論

從進(jìn)化的角度看,群體中的等位基因組成是長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物,群體中遺傳多樣性也是歷史的產(chǎn)物［12］,多態(tài)信息含量(PIC)是群體內(nèi)遺傳變異的重要度量指標(biāo),PIC越大說(shuō)明群體內(nèi)基因一致性越差、遺傳變異越大、選擇潛力越大,PIC值衡量基因變異程度高低反映遺傳信息的多少。Botstein等［13］提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo),當(dāng)PIC＞0.5時(shí),該基因座為高度多態(tài),當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)為中度多態(tài)基因座,PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)基因座。本研究中,P1位點(diǎn)的PIC為0.17屬于低度多態(tài)基因座,遺傳選擇潛力較小。而P2位點(diǎn)的PIC值為0.46達(dá)到了中度多態(tài),說(shuō)明選擇群體的MTNR1B基因一致性一般,有一定的選擇潛力。

在與開(kāi)產(chǎn)日齡以及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中,P1的3種基因型均沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異,說(shuō)明P1位點(diǎn)的基因突變并沒(méi)有引起產(chǎn)蛋性狀上的差異,屬于無(wú)效突變位點(diǎn)。P2位點(diǎn)中AD和AC基因型的開(kāi)產(chǎn)日齡顯著高于AA和AB基因型,AA和AD基因型的產(chǎn)蛋數(shù)極顯著高于AB基因型,AC基因型的產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于AB基因型,從數(shù)據(jù)可以看出,AD和AC基因型的開(kāi)產(chǎn)日齡較早,AA和AD的38周齡產(chǎn)蛋數(shù)較高。綜合考慮,AD基因型在開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)方面均具有較大的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述,P1位點(diǎn)的遺傳多樣性較低,而且與開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)沒(méi)有關(guān)聯(lián)性,但P2位點(diǎn)表現(xiàn)出中度多態(tài),與開(kāi)產(chǎn)日齡和38周齡產(chǎn)蛋數(shù)關(guān)聯(lián)性分析中,能夠找出與開(kāi)產(chǎn)日齡及38周齡產(chǎn)蛋數(shù)都相關(guān)的優(yōu)勢(shì)基因型。綜合考慮以上結(jié)果,MTNR1B基因有望成為瑤山雞高產(chǎn)選擇的候選基因,P2位點(diǎn)的SNPS有望成為產(chǎn)蛋性狀的潛在遺傳標(biāo)記。

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Genetic Diversity of YaoShan Chickens MTNR1B Gene and Correlation with Egg Production Traits

XU Long-xin,SHANG Yi-shun*,ZHU Li-li,WU Ge-min
（Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Guizhou Guiyang 550005,China）

To provide scientific basis for selection high yield breeding of GuiZhou YaoSh an chickens,the single nucleotide polymorphism and sequencing methods were used to study the genetic diversity of YanShan chickens MTNR1B gene,and correlationwith laying traits.The results showed that,AA,AC and BC genotypes were detected in P1,the genotype AA was the dominant type,the highest allele frequency of A was 0.90,the polymorphism information content was 0.17,three kinds of genotypes in P1were not existed significant difference with the age at first egg and the egg production of 38 week-phase.AA,AB,AC and AD genotypes were detected in P2,the genotype AC was the dominant type,the highest allele frequency of A was 0.51,the polymorphism information content was 0.46,AD and AC replied significant difference between AA and AB in the age at first egg,AA and AD showed highly significant difference（P＜0.01）with AB in the egg production,the egg production of AC genotype higher than that of AB genotype.

YaoShan chickens,MTNR1B gene,genetic diversity,egg production traits

S831.2

A

0258-7033（2015）09-0009-03

2014-10-23；

2014-11-22

貴州省體改項(xiàng)目（黔科合z字【2012】4004號(hào)）；貴州省農(nóng)業(yè)科技園區(qū)項(xiàng)目（黔科合nz字[2012］3027號(hào)）；貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種項(xiàng)目（黔農(nóng)育專(zhuān)字[2014］008號(hào)）；貴陽(yáng)市2013現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與農(nóng)村科技計(jì)劃（筑科合同[2013102］1-2-1號(hào)）；貴州省農(nóng)科院院基金（黔農(nóng)科合（基金）2011007）

徐龍?chǎng)危?981-），男，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：15286045978@163

*通訊作者：尚以順（1969-），男，碩士，研究員，主要從事草類(lèi)資源品質(zhì)選育與養(yǎng)畜利用等研究工作，E-mail：gzsyishun@vip.sina.com