楊洋　胡永紅　楊文革　曹崢　張棋

摘要：以多抗菌素生產(chǎn)菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382為試驗菌株，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗和中心組合試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面法建立發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化模型，得到最優(yōu)產(chǎn)多抗菌素的培養(yǎng)基：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L，F(xiàn)eSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L。經(jīng)試驗驗證，在此條件下，多抗菌素的效價可達(dá)2 300 μg/mL，比優(yōu)化前提高了40%。

關(guān)鍵詞：多抗菌素；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法；條件；效價

中圖分類號： S482.2+8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0154-04

目前，植物病害在全球范圍內(nèi)每年造成高達(dá)數(shù)千億美元的損失，而其中又以真菌病害最為嚴(yán)重。多抗菌素（polyoxins）也被稱為多效霉素，多抗霉素，多氧霉素，是一種抗真菌核苷類抗生素。多抗菌素能夠抑制真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的合成，被廣泛應(yīng)用于治療水稻紋枯病、梨黑斑病和番茄灰霉病等植物真菌病害，是一種有效防治植物真菌病害的生物農(nóng)藥[1-2]。多抗菌素作為一種廣譜性抗生素，具有良好的內(nèi)吸性和高度的靶標(biāo)生物選擇性，已成為國內(nèi)外殺菌、除蟲的一線藥物之一[3-4]。然而，在多抗菌素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，多抗菌素效價低、生產(chǎn)成本高、發(fā)酵周期長等問題限制了其推廣應(yīng)用[5-7]。因此，對多抗菌素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及條件初探具有重大意義。本研究以多抗菌素生產(chǎn)菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382為試驗菌株，應(yīng)用響應(yīng)面法系統(tǒng)考察了影響多抗菌素效價的培養(yǎng)基成分，得到最佳培養(yǎng)基配方，從而提高多抗菌素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

多抗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，由課題組保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖：20 g/L，瓊脂15～20 g/L，自然pH值；種子培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0。

1.3 主要試劑和儀器

試驗主要試劑：蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），F(xiàn)eSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、NaNO3、CuSO4、CaCO3（廣東汕頭市西隴化工廠）。

試驗儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、滅菌鍋（華粵行儀器有限公司）、醫(yī)用凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）、鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）、基礎(chǔ)分析型純水機(jī)（青島富勒姆科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 多抗菌素含量的測定 用管碟法測量發(fā)酵液中多抗菌素的含量。使用水稻紋枯菌為指示菌種，配制不同濃度的多抗菌素標(biāo)品，牛津杯裝液量為200 μL，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。根據(jù)不同濃度標(biāo)品和抑菌圈的大小，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 單因素試驗設(shè)計 分別對氮源、碳源、無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d，測定每種因素對多抗菌素含量的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.4.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

1.4.3.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計試驗 采用PB試驗從多個單因素中篩選出對多抗菌素發(fā)酵影響最顯著的幾個因素，使用Design Expert軟件設(shè)計試驗方案，包括11個變量（n=11），其中8個主要因素（蔗糖、麥芽糖、肌醇、蛋白胨、酵母膏、FeSO4、KH2PO4、CaCO3）和3個虛擬變量（表1），11個變量分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K來代表，每個變量有高（+）和低（-）2個水平，設(shè)置高（+）水平是低（-）水平的1.5倍，共進(jìn)行12組試驗（表2）。

1.4.3.2 最陡爬坡試驗 在PB試驗中得到了影響較為顯著的3個因素，并且根據(jù)PB設(shè)計得出的一次項擬合方程中相應(yīng)變量的系數(shù)，從而確定變化梯度和爬坡方向。若變量系數(shù)為負(fù)，則該變量水平以梯度遞減的方向進(jìn)行爬坡試驗。若變量系數(shù)為正，則該變量水平以梯度遞增的方向進(jìn)行爬坡試驗，這樣就能夠經(jīng)濟(jì)、快速地逼近最佳區(qū)域。將最陡爬坡試驗中得到的多抗菌素發(fā)酵產(chǎn)量最高點作為中心組合設(shè)計的的中心點來設(shè)計試驗方案。

1.4.3.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過最陡爬坡試驗，逼近多抗菌素最大化生產(chǎn)區(qū)域，根據(jù)中心組合設(shè)計（central composite design）原理，對經(jīng)過PB和爬坡試驗的變量進(jìn)行5水平試驗（-α、-1、0、+1、+α），共20組，使用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，研究多抗菌素的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 多抗菌素含量的測定

配制不同濃度的多抗菌素標(biāo)樣，使用管碟法（牛津杯法）測定不同濃度多抗菌素標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈大小，以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標(biāo)、多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。多抗菌素濃度在200～2 400 μg/mL范圍內(nèi)線性擬合度良好，其回歸方程為y=138.23x-2 058.46，x代表抑菌圈直徑，y代表多抗菌素濃度。相關(guān)系數(shù)r=0.998，說明該方程具有良好的相關(guān)性，可以用于多抗菌素含量的測定。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 氮源對多抗菌素發(fā)酵的影響 氮源在合成菌體蛋白質(zhì)、核酸、酶及各種初級和次級代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要的作用，同時在發(fā)酵生產(chǎn)中氮源還起著調(diào)節(jié)菌體的生長及生物量的作用。由圖2可知，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源對多抗菌素發(fā)酵的促進(jìn)作用更為顯著，在添加有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中，菌體生長良好，產(chǎn)物正常生成；而在添加無機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體生長較稀疏，并且無法產(chǎn)生多抗菌素，這可能是因為該鏈霉菌無法利用無機(jī)氮源來生產(chǎn)多抗菌素。在有機(jī)氮源中，酵母膏效果最好，蛋白胨次之。endprint

2.2.2 碳源對多抗菌素發(fā)酵的影響 碳源是構(gòu)成菌體的基本骨架，是菌體生長的能量來源，是各種代謝產(chǎn)物的重要來源，通過影響菌體的呼吸、能量、生長及相關(guān)代謝最終影響抗

生素等次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖3可知，在供試的8種碳源中蔗糖、麥芽糖和肌醇對多抗菌素發(fā)酵效果較為理想，其中蔗糖效果最好。其他5種碳源對多抗菌素生成的效果相對較差，該鏈霉菌對其他5種碳源利用率不高。

2.2.3 無機(jī)鹽對多抗菌素發(fā)酵的影響 在微生物生命活動中，無機(jī)鹽構(gòu)成菌體組成成分，作為酶的組成部分，酶的激活劑或是抑制劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓、pH值及氧化還原電位等。由圖4可知，添加KH2PO4多抗菌發(fā)酵效果最好，F(xiàn)eSO4和CaCO3次之。因此在下個階段的PB設(shè)計中，將KH2PO4、FeSO4 和CaCO3作為考察因素，其用量分別為0.2、0.5、1 g/L。

2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2.3.1 Plackett-Burman（PB）試驗 對多抗菌素發(fā)酵影響較大的8個主要因素，再加3個虛擬變量（表1）。每個變量有高（+）、低（-）2水平，共計12次試驗結(jié)果見表2。使用Design-Expert軟件對表2進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。由表3可知，上述8個因素對發(fā)酵生產(chǎn)多抗菌素的顯著性由大到小的順序為蔗糖、酵母膏、KH2PO4、麥芽糖、蛋白胨、肌醇、CaCO3、FeSO4，其中蔗糖為極顯著因素。該模型R2=0.975 9，表示該模型可以解釋97.59%的發(fā)酵產(chǎn)多抗菌素水平的變化。P值小于0.05表示該因素為顯著因素，從8個因素中選出對多抗菌素發(fā)酵生產(chǎn)影響顯著的因素（蔗糖、酵母膏、KH2PO4）進(jìn)行下一步試驗優(yōu)化。

2.3.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)PB試驗設(shè)計結(jié)果，蔗糖、酵母膏、KH2PO4的模型方程系數(shù)為正值，其濃度水平應(yīng)增加，根據(jù)3個因素的效應(yīng)值大小設(shè)計它們的變化方向及步長進(jìn)行最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計結(jié)果見表4。由表4可知，選擇第5組試驗方案時，即蔗糖20 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO4 0.7 g/L，對應(yīng)的多抗菌素發(fā)酵液效價達(dá)到最高值，以此值為中心值進(jìn)行響應(yīng)面試驗，這樣響應(yīng)面方程更能充分地逼近真實值。

2.3.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過Plackett-Burman試驗和爬坡試驗，確定蔗糖、酵母膏、KH2PO4的水平，利用Design-Expert 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗（表5）。根據(jù)表6結(jié)果，使用Design-Expert軟件進(jìn)行擬合，得到三元二次回歸方程y=2 021.98-160.49x1-55.76x2-77.29x3+6650x1x2-16.00x1x3+7.75x2x3-170.21x12-177.28x22-237.91x32，其中：y為多抗菌素效價，x1、x2、x3分別為蔗糖、酵母膏、KH2PO4濃度。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析

由二元回歸方程所得到的的響應(yīng)面圖與相應(yīng)的等高線圖見圖5至圖7。各因素交互作用對響應(yīng)值多抗菌素產(chǎn)量的影響由圖可以直觀地反應(yīng)出來[8-10]

圖5表明，在KH2PO4一定的情況下，蔗糖和酵母膏的交互作用顯著，隨著蔗糖和酵母膏含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。

由圖6可知，在酵母膏一定的情況下，隨著蔗糖和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，后期呈現(xiàn)下降趨勢。在一定程度上，提高培養(yǎng)基中蔗糖和KH2PO4的含量有利于提高多抗菌素效價，但蔗糖濃度過高會影響細(xì)胞通透性，抑制菌體生長，不利于多抗菌素產(chǎn)量的增加。

由圖7可知，在蔗糖一定的情況下，酵母膏和KH2PO4交互作用較顯著，隨著酵母膏和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效價不斷提高，但酵母膏對多抗菌素效價的影響大于KH2PO4對產(chǎn)量的影響。

為了能夠求出培養(yǎng)基的最佳配方，對回歸方程中各個變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得：x1=17.42，x2=18.72，x3=0.69，此時多抗菌素效價為2 076 μg/mL。并進(jìn)行試驗驗證，在最適發(fā)酵條件下，重復(fù)3次試驗，多抗菌素效價實測值2 300 μg/mL，與預(yù)測值基本符合，說明響應(yīng)面法對多抗菌素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化具有較強(qiáng)可靠性。因此，我們得到最佳培養(yǎng)基配方是：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)Plackett-Burman試驗確定

了蔗糖，酵母膏，KH2PO4為主要影響因素，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡試驗，確定最佳響應(yīng)面區(qū)域，然后采用中心組合試驗設(shè)計和Design Expert 軟件分析計算，得到這3種因素的添加量：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。經(jīng)過驗證在此發(fā)酵條件下多抗菌素效價達(dá)2 300 μg/mL。然而，此研究僅限于搖瓶發(fā)酵， 很多因素（如溶氧，通氣量等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發(fā)酵，進(jìn)一步優(yōu)化驗證影響多抗菌素發(fā)酵的條件。

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