通信作者：曾萬勇(1973-)，副教授，E-mail：vyzeng@163.com.

竹節(jié)參藥材化學(xué)成分指紋圖譜研究

任冰1，聶晶2，胡軍林2，李丹平2，陳平1，曾萬勇1

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430064)

摘要：建立竹節(jié)參藥材化學(xué)成分的指紋圖譜，為竹節(jié)參藥材的質(zhì)量分析及其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。采用HPLC法，C18色譜柱，以0.05%磷酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測波長為203 nm，建立了竹節(jié)參化學(xué)成分指紋圖譜。竹節(jié)參指紋圖譜共形成19個(gè)共有峰，通過對照品比對和HPLC-MS/MS分析，指認(rèn)了10個(gè)共有峰，分別是人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg2、Ro、Rg3、Rh2、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、Ⅰb、Ⅳa。主成分分析和聚類分析將14批藥材分為3類。主成分分析與聚類分析結(jié)果一致。所建立的竹節(jié)參化學(xué)成分指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠、可行，對于竹節(jié)參藥材的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：竹節(jié)參；化學(xué)成分；指紋圖譜，質(zhì)量控制

收稿日期：2015-05-04.

作者簡介：任冰(1991-)，女，碩士研究生，E-mail：237632469@qq.com.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)

文章編號：2095-7386(2015)03-0007-04

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.002

中圖分類號：R 284.1

HPLC fingerprint spectra for discrimination ofRhizomaPanacisJaponici

RENBing1，NIEJing2，HUJun-lin2，LIDang-ping，CHENPing1，ZENGWan-yong1*

(1.School of Biology and Pharmacy Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；

2.Hubei Institute for Food and Drug Control，Wuhan 430064，China)

Abstract：To establish the chemical composition fingerprints for identification and evaluation of Rhizoma Panacis Japonici.HPLC method was used to establish Rhizoma Panacis Japonici fingerprint to identify them with the mobile of acetonitrile -0.05% phosphoric acid water solution by gradient elution on an C18 column at the detection wavelength of 203 nm.Twenty two common peaks were defined in Rhizoma Panacis Japonici by fingerprint analysis in all. Ten of them were identified as ginsenoside Rg1、Re、Rb1、Rg2、Ro、Rg3、Rh2；Chikusetsu saponin Ⅳ，Ⅰb，Ⅳa by comparing with standard references or HPLC-MS/MS method . The samples of Rhizoma Panacis Japonici was classfied into 3 clusters by principal component analysis and cluster analysis.The HPLC fingerprint provides the experimental basis for manufacture and quality control of Rhizoma Panacis Japonici .

Key words：RhizomaPanacisJaponici；chemical composition ；fingerprint；the quality control

1引言

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖，略呈圓柱形，稍彎曲，有的具肉質(zhì)側(cè)根。長5—22 cm;直徑0.8—2.5 cm；表面黃色或黃褐色，粗糙，有致密的縱皺紋及根痕；節(jié)明顯，節(jié)間長0.8—2 cm，每節(jié)有1凹陷的莖痕；質(zhì)硬，斷面黃白色至淡黃棕色，黃色點(diǎn)狀維管束排列成環(huán)[1-2]。竹節(jié)參主要的化學(xué)成分為皂苷類，以齊墩果烷型和達(dá)瑪烷型皂苷為主，還含有竹節(jié)參多糖、揮發(fā)油類[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，竹節(jié)參的提取物或總皂苷具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[5-8]。由于氣候、生態(tài)環(huán)境的影響，不同產(chǎn)地的竹節(jié)參化學(xué)成分差異較大，僅以單一化學(xué)成分含量作為質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不能有效地控制竹節(jié)參藥材質(zhì)量。筆者通過考察不同產(chǎn)地的14批竹節(jié)參藥材，建立化學(xué)指紋圖譜，為竹節(jié)參藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2材料

DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，Waters ACQUITY UHPLC Xevo G2Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，HyperSonic DT-A超聲波清洗儀(湖北省鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司)。三七皂苷R1(批號110745-201308)、人參皂苷Rg1(批號110703-201128)、人參皂苷Re(110754-201324)、人參皂苷Rb1(批號110704-201223)、人參皂苷Rb2(批號111715-201203)、人參皂苷Rb3(批號111686-201203)、人參皂苷Rd(111818-201001)、人參皂苷Rg3(110804-200402)、人參皂苷Ro(批號111903-201303)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號111861-201102)，均為中國藥品生物制品檢定所提供。竹節(jié)參皂苷Ⅳ為實(shí)驗(yàn)室自制，純度檢測均大于98%。乙腈為色譜純(Merck.KGaA,USA)，磷酸、甲醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水由Millipore SYNERGY (UV)超純水機(jī)制得。竹節(jié)參藥材來源見表1，密封保存于陰涼干燥處。

3方法與結(jié)果

3.1色譜條件

Agilent ZORBAX Extent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)- 0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，見表2；檢測波長為203 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

3.2質(zhì)譜條件

離子源為ESI源，負(fù)離子掃描模式，錐孔電壓：40 V，毛細(xì)管電壓：2 600 V，離子源溫度：100 ℃，脫溶劑氣體流速：600 L/h，碰撞能量：50 V。梯度洗脫程序如3.1。

表1樣品來源及編號

序號來源備注S1四川汶川栽培S2湖北神龍架野生S3湖北宣恩縣七姊妹山野生S4湖北建始栽培S5湖北咸豐野生S6四川峨眉野生S7四川峨眉栽培S8廣西桂林野生S9貴州玉舍野生S10湖北恩施野生S11四川洪雅栽培S12四川龍池栽培S13湖北恩施栽培S14云南魯旬野生

表2梯度洗脫程序

時(shí)間/min乙腈(A)/%0.05%磷酸溶液(B)/%0—510905—1010—1590—8510—1515—2085—8015—2820—2580—7528—3325—3075—7033—6830—3570—6568—8135—7565—2581—9175—9025—1091—96901096—10690—1010—90

3.3對照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Ro；竹節(jié)參皂苷Ⅳa、Ⅳ；三七皂苷R1對照品適量，精密稱定，用甲醇配制為各對照品濃度為0.200 g·L-1的混合對照品溶液，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4供試品溶液的制備

精密稱定S1—S14樣品粉末(過四號篩)0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，浸泡2 h，再超聲處理45 min，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻過濾，0.22 μm微孔濾膜過濾，得到竹節(jié)參供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析。

3.5方法學(xué)考察

3.5.1精密度試驗(yàn)

取竹節(jié)參樣品S11按3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按3.1中方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測得相對保留時(shí)間RSD<0.5%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明儀器精密度良好。

3.5.2重復(fù)性試驗(yàn)

取竹節(jié)參樣品S11 6份，按3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按3.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，測得相對保留時(shí)間RSD小于0.3%，相對峰面積的RSD小于2.5%，表明方法重復(fù)性良好。

3.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取竹節(jié)參樣品S11按3.4項(xiàng)下制備供試品溶液，按3.1項(xiàng)下方法分別在0 h，8 h，12 h，24 h，48 h進(jìn)樣測定，測得相對保留時(shí)間RSD小于0.5%，相對峰面積的RSD小于3.0%，由此表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6樣品測定

將竹節(jié)參樣品S11—S14按3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按3.1項(xiàng)下的色譜條件下依次進(jìn)樣檢測，得到竹節(jié)參藥材的HPLC指紋圖譜，見圖1。

圖1　竹節(jié)參樣品(S1—S14)的HPLC指紋圖譜

3.7指紋圖譜分析

3.7.1聚類分析

將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行聚類分析，聚類方法采用word法，度量標(biāo)準(zhǔn)采用歐氏距離。聚類分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，14批竹節(jié)參樣品大致可以分為3類，當(dāng)010時(shí)，第Ⅱ類與第Ⅲ類才能聚在一起，說明S2與其它樣品之間差別較大。

圖2　聚類分析圖

3.7.2 主成分分析

將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行主成分分析。因子分析得到兩個(gè)主要的主成分，將主成分1和主成分2分別為X-軸和Y-軸，制成散點(diǎn)圖，如圖3所示。竹節(jié)參樣品可分為3類，第Ⅰ類為S1、S6、S7、S10、S12、S14，分布較為密集，樣品質(zhì)量較為一致；第Ⅱ類S8、S9、S11、S13，分布松散，與其它三批存在差異，但可以歸為一類；第Ⅲ類為S3、S4、S5，分布松散，S3與S4、S5差異較顯著。S2不在這3類中。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖3　主成分分析圖

3.7.3特征指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2010版)”，對14批竹節(jié)參進(jìn)行指紋圖譜分析。以竹節(jié)參樣品S11作為參照圖譜，生成特征指紋圖譜，共標(biāo)定19個(gè)共有峰，并進(jìn)行了相似度計(jì)算。竹節(jié)參藥材特征圖譜指紋見圖4。14批竹節(jié)參藥材指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果分別為：0.977，0.920，0.917，0.933，0.929，0.966，0.949，0.898，0.992，0.923，0.901，0.934，0.951，0.927。除樣品S8以外，其余樣品的相似度均在0.9以上，說明建立的竹節(jié)參化學(xué)成分指紋圖譜具有良好的代表性和專屬性，能夠用來控制其藥材質(zhì)量。

1.人參皂苷Rg 1；2.人參皂苷Re ；4.人參皂苷Rb 1；6.人參皂苷Ro ；8.竹節(jié)參皂苷Ⅳ；10.竹節(jié)參皂苷Ⅳa；11.竹節(jié)參皂苷Rg 3 圖4　竹節(jié)參(A)HPLC指紋圖譜和對照品色譜圖(B)

建立的竹節(jié)參特征指紋圖譜共形成19個(gè)特征峰，通過對照品對比及HPLC-MS/MS推斷，指認(rèn)了10個(gè)峰，分別為人參皂苷Rg1(1號峰)、人參皂苷Re(2號峰)、人參皂苷Rb1(4號峰)、人參皂苷Rg2(5號峰)、人參皂苷Ro(6號峰)、竹節(jié)參皂苷Ⅳ(8號峰)、竹節(jié)參皂苷Ⅰb(9號峰)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(10號峰)、人參皂苷Rg3(11號峰)、人參皂苷Rh2(12號峰)。HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)推測結(jié)果見表3。

表3HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)推測結(jié)果

峰號tR/min[M-H]-碎片離子分子式化合物540.04783.4673.3,475.3C42H72O13人參皂苷Rg2[9]953.25925.4763.4,569.3C47H73O18竹節(jié)參皂苷Ⅰb[10-11]1277.17621.3475.3C36H62O8人參皂苷Rp[11-12]

4討論

竹節(jié)參為傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用價(jià)值較高。《中國藥典》2010年版中竹節(jié)參項(xiàng)下為顯微鑒別和以人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為指標(biāo)的薄層鑒別，還未有建立含量測定指標(biāo)。僅以顯微和薄層鑒別不能全面的反映藥材的質(zhì)量差異。筆者采用HPLC法建立了竹節(jié)參指紋圖譜，共形成19個(gè)共有峰，通過對照品比對和HPLC-MS/MS對10個(gè)共有峰進(jìn)行了定性鑒別。還采用相似度評價(jià)、聚類分析和主成分分析等分析方法，對不同產(chǎn)地的14批竹節(jié)參藥材質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。不同產(chǎn)地的竹節(jié)參化學(xué)成分相似度較好，但仍然存在著質(zhì)量差異。本研究對于竹節(jié)參藥材的質(zhì)量控制和鑒別提供了依據(jù)。但對于建立的指紋圖譜中未能指認(rèn)的共有峰，仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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