當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)骨髓輻射損傷過程中NF-κB及bax、bcl-2表達(dá)的影響

王曉玲趙舒武王媛媛1王娟娟1汪濤

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津300193)

摘要〔〕目的觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)骨髓輻射損傷過程中核因子(NF)-κB及下游因子bax、bcl-2表達(dá)的影響。方法取原代培養(yǎng)7 d的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用137Cs-γ射線(4 Gy)照射，在照射后24 h用含不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清干預(yù)24 h；小鼠同劑量γ射線照射后，灌胃給藥同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯1 w，處死小鼠取骨髓。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，real-time RT-PCR分別檢測(cè)輻射損傷骨髓基質(zhì)細(xì)胞模型和小鼠模型骨髓的NF-κB及下游因子bax、bcl-2的表達(dá)。結(jié)果輻射可激活NF-κB信號(hào)，啟動(dòng)MSC和骨髓細(xì)胞凋亡過程。經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)，MSC和骨髓細(xì)胞內(nèi)可下調(diào)NF-κB基因的表達(dá)，但隨著藥物劑量加大下調(diào)趨勢(shì)減緩(P<0.05)；當(dāng)MSC和骨髓細(xì)胞內(nèi)bcl-2/bax比值升高時(shí)，對(duì)促凋亡信號(hào)敏感性減弱，表現(xiàn)出抗凋亡的特點(diǎn)，細(xì)胞存活壽命延長(P<0.05)。結(jié)論當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過影響NF-κB的表達(dá)調(diào)節(jié)bcl-2/bax，減少骨髓內(nèi)細(xì)胞凋亡，有利于輻射損傷后機(jī)體造血免疫機(jī)能的恢復(fù)。

關(guān)鍵詞〔〕當(dāng)歸補(bǔ)血湯；輻射損傷；骨髓；凋亡

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273892)；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(20100205)；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(11030)

通訊作者：汪濤(1961-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事干細(xì)胞生物學(xué)研究。

1天津中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院

第一作者：王曉玲(1976-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥防治輻射損傷機(jī)制研究。

Effect of Danggui buxue decoction on NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of mouse bone marrow in the process of radiation damage

WANG Xiao-Ling, ZHAO Shu-Wu, WANG Yuan-Yuan,etal.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Danggui buxue decoction on inhibiting bone marrow from apoptosis.MethodsBone marrow stromal cells (BMSCs) from mice were primary cultured for 7 days and then radiated by 137Cs-gamma ray (4 Gy). After irradiation for 24 h, BMSCs were cultured in the different concentration serum containing drug of Danggui buxue decoction for 24 h. After radiated by the same dose of gamma ray, mice were given the same dose of Danggui buxue decoction by intragastric administration for one week, and then sacrificed and extracted bone marrow. NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of BMSCs and mice bone marrow radiated by gamma ray were detected separately by immunofluorescence technique and real-time fluorescence quantitative RT-PCR method.ResultsNF-kappa B signal activated by radiation could start the process of BMSCs and bone marrow cells apoptosis. BMSCs and bone marrow cells down regulated the expression of NF-kappa B after the intervention of Danggui buxue decoction; but with dose increasing, a downward trend was slowed (P<0.05). When the bcl-2/bax ratio increasing in BMSCs and bone marrow cells, the apoptotic signals sensitivity was decreased and cells showed the anti-apoptotic specialty and life extension(P<0.05).ConclusionsDanggui buxue decoction could affect the expression of NF-kappa B and then adjust the bcl-2/bax ratio in order to reduce cell apoptosis in bone marrow radiated by gamma ray, and furthermore is conducive to the recovery of hemopoiesis and immune function after radiation injury.

【Key words】Danggui buxue decoction; Radiation damage; Bone marrow; Apoptosis

骨髓功能障礙是輻射對(duì)人體造成的主要傷害之一，電離輻射不僅可損傷骨髓內(nèi)增殖活躍的造血細(xì)胞，同時(shí)也可對(duì)骨髓造血微環(huán)境造成一定程度的傷害。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)是構(gòu)成造血微環(huán)境的重要組成部分，主要包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等。輻射屬于外感熱毒邪毒，可直中臟腑、傷陰和致氣血不足，其基本病機(jī)是氣血兩虛及血淤，故骨髓輻射損傷屬于中醫(yī)“虛勞”、“氣血虛”病癥。出自金元時(shí)代李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》的當(dāng)歸補(bǔ)血湯是補(bǔ)益氣血的代表方，具有補(bǔ)氣生血之功效，主治勞倦內(nèi)傷、氣血虛弱諸癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有益氣補(bǔ)血、滋補(bǔ)排毒、抗輻射的功效，但具體的作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)主要探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)抗輻射致細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物SD大鼠60只，體重(200±15)g；昆明種小鼠100只，體重(20±0.5)g，雌雄不限，均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk2005-0001。

1.2試劑DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)、特級(jí)胎牛血清(Hyclon公司)、MTT(Sigma公司)；NF-κB、bax、bcl-2兔多克隆抗體(Santa cruz公司)、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Immunoreagents公司)；RNA提取純化試劑盒、RT-qPCR專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qRCP試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；當(dāng)歸，黃芪飲片(天津中新藥業(yè))。

1.3方法

1.3.1不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎劑及載藥血清的制備依據(jù)當(dāng)歸補(bǔ)血湯用藥量(36 g飲片·kg-1體重·d-1)及“人和動(dòng)物體表面積折算法”計(jì)算出小鼠臨床等效劑量為4.5 g/kg，3倍劑量為13.5 g/kg，5倍劑量為22.5 g/kg。將中藥復(fù)方1劑按照當(dāng)歸與黃芪1∶5的量浸泡在蒸餾水中，每克中藥加水6 ml，泡30 min。武火煮沸后，文火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原渣每克加水4 ml，再煎煮40 min，過濾取煎液，兩者混合，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將大鼠隨機(jī)分成4組，其中三組灌胃相當(dāng)于大鼠臨床等效劑量、3倍劑量、5倍劑量的黃芪當(dāng)歸合煎液(藥物用量計(jì)算依據(jù)同前)，每只6 ml/d，2次/d，連續(xù)給藥4 d，第4天灌胃后禁食，次晨灌服1次，1 h后無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，密封，-20℃凍存。對(duì)照血清的制備：每日灌胃同體積的水，血清制法同前。

1.3.2MSC培養(yǎng)、分組及干預(yù)無菌條件下取出小鼠雙側(cè)股骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基沖出骨髓吹打成單細(xì)胞懸液，離心后將細(xì)胞沉淀用含10%FBS的培養(yǎng)基懸浮，接種于培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后換液，吸出懸浮細(xì)胞。此后每隔2 d換液1次。7 d后細(xì)胞貼壁生長并基本融合。此時(shí)將MSC 經(jīng)137Cs-γ射線(4 Gy)照射5 min(空白對(duì)照組不照射)。照射24 h后，除空白對(duì)照組外其余細(xì)胞均用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2遍，加入不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清進(jìn)行干預(yù)，24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。細(xì)胞分組：①空白對(duì)照組：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；②照射組：細(xì)胞照射后用含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；③給藥1組：細(xì)胞照射后用含10%等效劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；④給藥2組：細(xì)胞照射后用含10% 3倍劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；⑤給藥3組：細(xì)胞照射后用含10% 5倍劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3照射小鼠模型的制作、分組及干預(yù)小鼠裝入有機(jī)玻璃鼠盒內(nèi)，經(jīng)4 Gy137Cs-γ射線全身一次性照射5 min(正常組不進(jìn)行照射)。照射后在無菌層流架內(nèi)飼養(yǎng)，水、飼料、墊料均經(jīng)高溫高壓消毒。將75只小鼠隨機(jī)分為正常組、照射組(僅照射)、給藥1組(照射后給等效劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯)、給藥2組(照射后給3倍劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯)、給藥3組(照射后給5倍劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯)，每組15只。照射后給藥各組每天定時(shí)灌胃當(dāng)歸補(bǔ)血湯0.5 ml/只，持續(xù)7 d，同樣條件下正常組和照射組灌胃生理鹽水，飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.4MTT法檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下MSC的存活率將MSC培養(yǎng)6 d后，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使其同步化，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清作用24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，加入DMSO150 μl，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處光密度(OD)值。

1.3.5免疫熒光顯微技術(shù)觀察MSC損傷模型的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亞細(xì)胞定位將無水甲醇固定的MSC爬片，封閉，分別滴加NF-κB、bcl-2及bax一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜，滴加FITC標(biāo)記的二抗工作液(1∶200)，在濕暗盒內(nèi)37℃孵育30 min，Hoechst33258工作液染核，漂洗，滴加封片劑封片，暗盒保存，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6real time RT-PCR檢測(cè)輻射損傷的MSC和小鼠NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表達(dá)(1)MSC及小鼠骨髓總RNA提?。喊凑誖NA提取純化試劑盒說明書提供的方法提取總RNA，-80℃保存。(2)MSC及小鼠骨髓總RNA反轉(zhuǎn)合成cDNA：按RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書冰上操作，依次加入反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4℃冷卻。合成的cDNA 放在-20℃保存。(3)real-time PCR反應(yīng)：以β-actin作內(nèi)參照，其序列為(引物擴(kuò)增長度154 bp)：上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′；NF-κB序列(引物擴(kuò)增長度111 bp)：上游引物：5′-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3′；下游引物：5′-TGTTGACAGTGGTATTTCTGGTG-3′；bax序列(引物擴(kuò)增長度137 bp)：上游引物：5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′；下游引物：5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′；bcl-2序列(引物擴(kuò)增長度120 bp)：上游引物：5′-ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC-3′；下游引物：5′-GGTATGCACCCAGAGTGATGC-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃變性5 s，60℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 s。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1照射后24 h不同培養(yǎng)條件下MSC增殖情況當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清可明顯減少輻射損傷后MSC的凋亡(P<0.05)，但隨著藥物作用濃度增高抗凋亡作用減弱，等效劑量載藥血清抗凋亡效果最佳(P<0.05)。見表1。

表1　照射后24 h不同培養(yǎng)條件對(duì)MSC存活的

與照射組相比：1)P<0.05，與空白對(duì)照組相比：2)P<0.05

2.2免疫熒光顯微技術(shù)觀察MSC輻射損傷后的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亞細(xì)胞定位在輻射損傷后24 h，NF-κB蛋白主要位于MSC細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)內(nèi)，呈綠色熒光。bcl-2蛋白主要位于MSC胞質(zhì)內(nèi)，凋亡的MSC表達(dá)程度較弱或不表達(dá)，呈較暗的綠色熒光。照射組只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)，熒光較暗，給藥各組的表達(dá)程度強(qiáng)于照射組，熒光亮度較強(qiáng)。bax蛋白在MSC內(nèi)表達(dá)部位及熒光色澤與bcl-2相同，但表達(dá)強(qiáng)度的寓意不同，凋亡的MSC表達(dá)程度較強(qiáng)。照射組表達(dá)細(xì)胞數(shù)量多，熒光亮度強(qiáng)，見圖1。給藥組表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量和熒光亮度均弱于照射組。

2.3real-time RT-PCR檢測(cè)輻射損傷的MSC和小鼠骨髓NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表達(dá)在照射24 h后，各實(shí)驗(yàn)組MSC NF-κB的表達(dá)相對(duì)于空白對(duì)照組均明顯下降，給藥各組下調(diào)幅度更大，但隨著藥物劑量加大，下調(diào)幅度減弱(P<0.05)；各給藥組bcl-2/bax的比值相對(duì)于正常組均明顯下降，與照射組相比下降幅度減小，隨著藥物劑量加大下調(diào)幅度增加(P<0.05)。見表2。

A:NF-κB的表達(dá)；B:bcl-2的表達(dá)；C:bax的表達(dá)；①照射組；②給藥1組；③給藥2組；④給藥3組 圖1　免疫熒光顯微鏡觀察MSC中NF-κB、bcl-2、bax的表達(dá)

組別NF-κBbaxbcl-2正常組1±01)1±01)1±01)照射組0.9431±0.00032)1.8707±0.00042)0.7705±0.00032)給藥1組0.5966±0.00061)2)1.2097±0.00041)2)0.6668±0.00061)2)給藥2組0.5985±0.00071)2)1.1554±0.00061)2)0.5960±0.00031)2)給藥3組0.6294±0.00121)2)1.2479±0.00041)2)0.6419±0.00041)2)

與照射組比較：1)P<0.05；與正常組比較：2)P<0.05；下表同

在照射1 w后，除給藥1組變低之外，其余各組小鼠骨髓NF-κB的表達(dá)均明顯增高，隨著小鼠灌胃藥物劑量加大，表達(dá)上調(diào)明顯(P<0.05)；各給藥組小鼠骨髓bcl-2/bax的比值相對(duì)于正常組明顯上升，與照射組相比各給藥組bcl-2/bax比值均上升，隨著藥物劑量加大，上升幅度增加(P<0.05)。見表3。

表3　照射1 w后各組骨髓NF-κB、bax及

3討論

當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪、當(dāng)歸兩味藥以5∶1配伍而成，當(dāng)歸、黃芪中含有多種有效成分如當(dāng)歸多糖、黃芪多糖、阿魏酸、黃芪黃酮類及甲苷等，具有益氣補(bǔ)血、滋補(bǔ)排毒、抗輻射的功效，可以保護(hù)因輻射損傷的造血免疫系統(tǒng)，但具體機(jī)制尚未明晰。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為同源或異源亞基形成的二聚體，可與核內(nèi)DNA上的κB序列或胞質(zhì)中IκB家族成員結(jié)合。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB結(jié)合成三聚體存在胞質(zhì)中；當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、病毒、活性氧自由基、鈣離子載體、紫外線及射線等信號(hào)刺激時(shí)，IκB的亞單位發(fā)生磷酸化激活，泛素化后被蛋白水解酶降解，釋放出的NF-κB發(fā)生核易位，特異性結(jié)合到基因上的κB位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡功能〔1〕。NF-κB可通過對(duì)其下游基因如bcl-2、bax及CyclinD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的增殖分化、凋亡與細(xì)胞周期的控制〔2，3〕。本研究過程中發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號(hào)既能誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，也能誘導(dǎo)促凋亡基因的表達(dá)，抗凋亡還是促凋亡取決于激活信號(hào)的差異和所在細(xì)胞的類型〔4〕。

骨髓內(nèi)細(xì)胞極易受到輻射損傷，導(dǎo)致人體造血免疫功能障礙。射線可傷及骨髓內(nèi)重要的造血細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，啟動(dòng)這些細(xì)胞的凋亡過程。NF-κB的激活是細(xì)胞凋亡通路的始動(dòng)因素，而Bcl-2家族成員比例關(guān)系是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，特別是bcl-2/bax比值是決定細(xì)胞生死的“平衡砝碼”。bax和bcl-2以同源或異源二聚體的形式來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程：當(dāng)bax-bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；bax-bcl-2形成異源二聚體時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡〔5〕。

在輻射損傷后，MSC和骨髓細(xì)胞凋亡過程均由NF-κB信號(hào)分子活化啟動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射可激活體內(nèi)外細(xì)胞NF-κB信號(hào)分子，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序，當(dāng)歸補(bǔ)血湯以其多藥效部位多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)，通過對(duì)參與細(xì)胞凋亡的NF-κB-bcl-2-bax信號(hào)通路，發(fā)揮其抗輻射損傷的作用，減少骨髓內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)，保護(hù)了機(jī)體的造血免疫器官。但實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了離體與在體間同一指標(biāo)的變化差異，這可能與動(dòng)物體內(nèi)參與細(xì)胞凋亡的環(huán)境更為復(fù)雜有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-09-29修回〕

(編輯郭菁/徐杰)