通信作者：高曉黎，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：新藥研究，E-mail:xli_g@126.com。

不同動(dòng)物皮膚對(duì)黃體酮乳膏體外經(jīng)皮透過(guò)性的比較

陶虹1,2， 劉爭(zhēng)光3， 周湘龍1， 高曉黎1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所， 烏魯木齊830002；3新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)， 烏魯木齊830002)

摘要：目的考察黃體酮乳膏在不同動(dòng)物離體皮膚中的透皮吸收性能。方法選用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、比格犬和小型豬的離體皮膚，采用Franz擴(kuò)散池法，用高效液相色譜法測(cè)定接收液中的黃體酮含量，并進(jìn)行不同模型的擬合。結(jié)果黃體酮乳膏透皮動(dòng)力學(xué)行為符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。小鼠腹部皮膚對(duì)黃體酮的穩(wěn)態(tài)透皮速率(Js)為(8.854 3±0.741 1) μg·cm-2·h-1，在6種動(dòng)物皮膚中最高，與其他5種動(dòng)物皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論選擇小鼠腹部皮膚作為體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，黃體酮乳膏的透皮吸收效果最好。

關(guān)鍵詞：黃體酮； 體外透皮吸收； 動(dòng)物腹部皮膚； 高效液相色譜法

基金項(xiàng)目：烏魯木齊市高新區(qū)創(chuàng)新基金(CX10208W)

作者簡(jiǎn)介：陶虹(1975-)，女，在讀博士，副主任藥師，研究方向：藥物新劑型。

中圖分類號(hào)：R944

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.011

[收稿日期：2014-06-01]

Comparison of transdermal pemeability of progesterone cream on

different animals′ skin

TAO Hong1,2, LIU Zhengguang3, ZHOU Xianglong1, GAO Xiaoli1

(1XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InstituteForFoodandDrug

ControlofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830004，China;3XinjiangAgriculture

University，Urumqi830052,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the transdermal permeability of progesterone cream on different animals′ skin, and suggest the suitable animal′s skin for prescription screening. MethodsFranz diffusion cell and HPLC were used to detect the concentration of progesterone in receiving solution. ResultsAbdominal skin of rats had the best effect of the transdermal penetration of progesterone; the 24 h-accumulated permeation of progesterone reached the maximum and percutaneous rate was the highest. ConclusionAbdominal skin of rats is the most suitable model for proscription screening of transdermal progesterone delivery system.

Key words: progesterone; percutaneous permeability; abdominal skin of animals; high efficiency liquid chromatography

黃體酮是一種天然孕激素類藥物，使用已有50多年的歷史，其被廣泛應(yīng)用于臨床治療先兆流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)、子宮功能性出血、子宮內(nèi)膜異位等婦產(chǎn)科疾病，是目前激素替代治療中較理想的孕激素[1-3]。此外，其也應(yīng)用于體外受精作用中的黃體支持[4]和非婦產(chǎn)科疾病中，如輸卵管結(jié)石、腎絞痛、膽總管結(jié)石與膽絞痛、前列腺增生癥、食管癌等疾病的輔助治療[5-6]。黃體酮常用劑型為口服膠囊和油溶注射劑，口服制劑首過(guò)效應(yīng)比較強(qiáng)，油溶注射劑長(zhǎng)期注射易造成疼痛和硬節(jié)[7-8]。因此近年來(lái)不斷探索其他的給藥途徑。黃體酮分子量為314.47 Da，脂溶性強(qiáng)，是一種較為理想的透皮給藥候選藥物，因此目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃體酮透皮給藥系統(tǒng)均有研究[9-10]。經(jīng)研究證實(shí)，黃體酮經(jīng)皮下、直腸、陰道給藥后均可被吸收[11]。透皮吸收制劑可以避開胃腸道降解和肝首過(guò)效應(yīng)，并且可提高用藥的安全性。國(guó)外的同類產(chǎn)品有黃體酮脂質(zhì)體霜、黃體酮脂質(zhì)體身體乳、女性乳膏、女性更年期乳霜、天然黃體酮身體乳、婦女平衡霜、孕酮霜等[12-20]，但目前國(guó)內(nèi)尚未有同類上市產(chǎn)品。本研究將自制的黃體酮水包油型乳膏，采用改良Freeze擴(kuò)散池法進(jìn)行體外透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，收集不同時(shí)間點(diǎn)的接受液，用HPLC法測(cè)定接受液中黃體酮濃度，計(jì)算累計(jì)滲透量并對(duì)不同方程進(jìn)行擬合，并比較常用的小鼠、大鼠、豚鼠、兔、比格犬和小型豬6種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體皮膚對(duì)黃體酮乳膏的透過(guò)特性，以期為黃體酮透皮吸收制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1動(dòng)物、儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠10只，體質(zhì)量(25±5) g，許可證號(hào)SYXK(新)2010-0003；大鼠10只，體質(zhì)量(140±20)g, 許可證號(hào)SYXK(新)2010-0003；家兔1只，體質(zhì)量2.5 kg，許可證號(hào)SYXK(新)2010-0002；豚鼠2只，體質(zhì)量(220±20)g；比格犬1只，體質(zhì)量10 kg，許可證號(hào)SYXK(新)2010-0001；實(shí)驗(yàn)用小型豬1只，體質(zhì)量20 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為雌性動(dòng)物。

1.2儀器與材料TP-3 型智能透皮擴(kuò)散儀(南京新聯(lián)電子設(shè)備有限公司)，島津LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)，Saterus AE200 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。自制黃體酮乳膏(批號(hào)：20121004，規(guī)格：2%)，空白基質(zhì)(批號(hào)：20100501)，黃體酮對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100027-200307)，甲醇、乙腈和乙醇均為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物離體皮膚的制備小鼠：腹部涂抹脫毛劑，15 min后用溫水洗凈，正常飼養(yǎng)24 h后處死，取腹部皮膚。大鼠、豚鼠、家兔、比格犬和實(shí)驗(yàn)用小型豬： 均在處死后立即用電動(dòng)剃須刀將腹部毛剃除，取腹部皮膚。小心剪除皮下脂肪后反復(fù)用生理鹽水清洗干凈，切割成合適的小塊皮膚置-20℃冰箱冷凍保存。

1.3.2體外透皮實(shí)驗(yàn)從冰箱中取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚，置生理鹽水中30 min自然解凍。將皮膚置于擴(kuò)散池上固定，角質(zhì)層向上，真皮層面向接受池。用濾紙吸干皮膚表面的水分，將自制的黃體酮乳膏均勻涂抹在皮膚表面。接收液溫度為37℃，電磁攪拌速度為200 r/min，擴(kuò)散面積為1.3 cm2。分別于1、2、4、6、8、24 h取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫的接收液1 mL。樣液均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)結(jié)果按下式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)透過(guò)量Q(μg/cm)：

[Cn：t 時(shí)間濃度的測(cè)量值(μg/mL)；Ci：t 時(shí)間以前濃度的測(cè)量值(μg/mL)；Vo：接收液的總體積(mL)；Vi：每次取樣的體積(mL)；A：擴(kuò)散池面積(cm2)]。

1.3.3不同接收液的比較黃體酮屬于甾體激素、脂溶性物質(zhì)，在水中微溶。接收液中可加入聚乙二醇(PEG)作為甾體激素的助溶劑，或在接收液中加入乙醇均會(huì)大大增加甾體激素的溶出[21]。比較黃體酮乳膏分別以15%PEG+20%乙醇+生理鹽水和20%乙醇+生理鹽水為接收液的透皮效果。

1.3.4空白對(duì)照取空白乳膏均勻涂抹在固定好的離體皮膚表面，按照“1.3”項(xiàng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定接受液的吸收值，監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白乳膏的影響，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3.5高效液相色譜法色譜柱為Waters 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水(75∶25)，流速為1.0 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密量取500 μg/mL黃體酮儲(chǔ)備液適量，用20%乙醇生理鹽水稀釋成一系列對(duì)照溶液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾入進(jìn)樣小瓶，進(jìn)樣20 μL。以黃體酮主峰峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=75 321C-4 173.3，線性范圍為0.033～22.2 μg/mL(r=0.999 9)，最低檢測(cè)限為22 ng/mL。低、中、高3個(gè)濃度的方法回收率分別為100.7%、98.7%和98.4%。黃體酮主峰保留時(shí)間為10.903 min，與相鄰雜質(zhì)分離度>1.5。系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)和小鼠24 h透皮接收液的高效液相色譜圖見圖1、2。

圖1　系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

圖2　小鼠24 h透皮接收液

2結(jié)果

2.1不同接收液的比較結(jié)果2種接受液均符合漏槽條件。以15%聚乙二醇+20%乙醇+生理鹽水作為接收液的累計(jì)滲透曲線方程為Q=7.696 6t-8.746 0，r=0.998 5；以20%乙醇+生理鹽水作為接收液的累計(jì)滲透曲線方程為Q=8.854 3t-14.606 7，r=0.996 5。兩組數(shù)據(jù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中聚乙二醇的加入并沒有增加黃體酮的穩(wěn)態(tài)透皮速率(Js)，但增加了接收液的粘度，故選擇20%乙醇+生理鹽水為接收液。

2.2體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)公式計(jì)算出黃體酮透過(guò)小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、比格犬和小型豬腹部皮膚的累計(jì)滲透量。分別以一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuchi方程、Hixcon-Crowell方程和 Riteger-Peppas 方程進(jìn)行擬合，擬合方程的優(yōu)劣按照 R值判斷，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合的相關(guān)系數(shù)均>0.98，相對(duì)于其他3種方程的相關(guān)系數(shù)分布更均勻，表明黃體酮的體外滲透過(guò)程更符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。所得的直線斜率為穩(wěn)態(tài)透皮速率(Js)，在橫坐標(biāo)上的截距為藥物透皮吸收的時(shí)滯Tlag(h)，結(jié)果見表1。

表1　6種動(dòng)物皮膚透皮吸收的方程擬合

黃體酮乳膏透過(guò)6種動(dòng)物皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率大小順序依次為：小鼠>豚鼠>家兔>大鼠>比格犬>小型豬。對(duì)6種動(dòng)物皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果小鼠與其他動(dòng)物皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；大鼠與豚鼠和家兔的穩(wěn)態(tài)透皮速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；比格犬與小型豬差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而比格犬和小型豬與其他4種動(dòng)物的穩(wěn)態(tài)透皮速率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3動(dòng)物腹部的離體皮膚厚度實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同種類動(dòng)物皮膚厚度差異較大，除了大鼠和家兔以外，藥物在皮膚中的穩(wěn)態(tài)透皮速率大小隨著皮膚厚度的增加而減小。6種動(dòng)物離體皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率及厚度測(cè)量結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程穩(wěn)態(tài)透皮速率/(μg·cm-2·h-1)時(shí)滯/h皮膚厚度/mm小鼠Q=8.8543t-14.60678.8543±0.74111.60.4017±0.0217大鼠Q=2.6885t-5.02102.6885±0.29691.90.5983±0.0317豚鼠Q=3.6549t-6.05033.6549±0.16411.70.6983±0.0550家兔Q=3.4835t-3.23513.4835±0.58970.91.0400±0.1667比格犬Q=0.6985t-0.31600.6985±0.05130.50.9600±0.0783小型豬Q=0.4152t-1.23490.4153±0.02062.90.9683±0.0767

3討論

體外透皮實(shí)驗(yàn)最理想的皮膚是人的皮膚，因?yàn)橛闷淝蟪龅膮?shù)最接近臨床實(shí)際，但是人的皮膚來(lái)源少，很難獲得，所以選用合適的動(dòng)物皮膚來(lái)研究透皮吸收具有重要的意義。

有較多文獻(xiàn)報(bào)道豬的皮膚特性與人的最為接近[22]。豬皮膚中的汗腺是頂泌汗腺，分布于真皮和脂肪相接的真皮深層。研究表明，巴馬小型豬與人的真皮厚度、表皮厚度和真皮/表皮厚度比值上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[23]，所以本研究亦選用了小型豬的腹部皮膚，從豬的實(shí)驗(yàn)參數(shù)可以大致推斷出黃體酮在人皮膚上的滲透情況，為預(yù)測(cè)人體對(duì)黃體酮的吸收提供理論參考。

豚鼠和家兔皮膚非常敏感，常用于皮膚致敏和刺激實(shí)驗(yàn)；大鼠常用于藥理的急性毒性、長(zhǎng)期毒性以及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)；小鼠和大鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，皮膚最易得，因此常用于透皮吸收制劑處方的篩選。故本研究考察了黃體酮乳膏在這幾種動(dòng)物皮膚的透過(guò)性差異。小鼠皮膚對(duì)黃體酮乳膏的穩(wěn)態(tài)透皮速率最快，所以對(duì)處方中的成分改變會(huì)較其他5種動(dòng)物皮膚敏感。比格犬和小型豬皮膚的穩(wěn)態(tài)透皮速率均較低，不適合作為黃體酮透皮制劑處方篩選的動(dòng)物模型，但其數(shù)據(jù)可以作為人體透皮吸收過(guò)程的參考。目前透皮吸收制劑體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究多選擇小型豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此本研究結(jié)果也為黃體酮乳膏分析體內(nèi)外吸收相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果也可為與黃體酮化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)在不同動(dòng)物皮膚中的透過(guò)性提供參考。

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(本文編輯施洋)