王　 靜　王　娟

(1. 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)青島市中醫(yī)醫(yī)院兒一科，山東　青島　266033；2.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)檢驗(yàn)科，山東　青島　266033 )

補(bǔ)腎健脾方對(duì)腎病綜合征模型大鼠性腺功能及病理結(jié)構(gòu)的影響*1

王 靜1王娟2

(1. 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)青島市中醫(yī)醫(yī)院兒一科，山東青島266033；2.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)檢驗(yàn)科，山東青島266033 )

摘要：目的探討補(bǔ)腎健脾方對(duì)腎病大鼠性激素和性腺功能及病理結(jié)構(gòu)的影響。方法采用鹽酸阿霉素大鼠尾靜脈注射建立實(shí)驗(yàn)性腎病綜合征大鼠，分別觀察環(huán)磷酰胺(CTX)單用及與補(bǔ)腎健脾方聯(lián)合使用對(duì)腎病大鼠性激素的影響，觀察腎組織和睪丸切片病理學(xué)改變。結(jié)果補(bǔ)腎健脾方和CTX聯(lián)合使用與單獨(dú)使用CTX相比，二者聯(lián)合使用可使大鼠的血清睪酮(Ts)含量明顯高于CTX致性腺損傷大鼠的Ts含量，同時(shí)具有降低卵泡刺激素(FSH)，促黃體生成素(LH)含量，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，調(diào)節(jié)性激素水平趨向正常。且二者聯(lián)合使用組大鼠睪丸組織切片無明顯病理學(xué)變化。結(jié)論補(bǔ)腎健脾方可保護(hù)和促進(jìn)生殖機(jī)能，并可能通過促進(jìn)下丘腦—垂體—性腺軸的組織形態(tài)學(xué)改變和調(diào)節(jié)其內(nèi)分泌、以及清除自由基，發(fā)揮對(duì)抗或減輕CTX的性腺毒性的作用。

關(guān)鍵詞：腎病綜合征；補(bǔ)腎健脾中藥；環(huán)磷酰胺；性腺；大鼠

腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)是由多種病因和多種病理類型引起腎小球疾病中的一組臨床綜合征，典型臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿(每日≥3.0～3.5 g)、低蛋白血癥(血漿白蛋白<30 g/l)、高脂血癥和水腫。NS是小兒泌尿系常見病，其中難治性腎病綜合征(Refractory Nephrotic Syndrome，RNS)約占NS的50%左右，臨床治療頗為棘手。難治性腎病綜合征(Refractory Nephrotic Syndrome，RNS)是指對(duì)激素抵抗、依賴和經(jīng)常復(fù)發(fā)(1年內(nèi)復(fù)發(fā)3 次以上或半年內(nèi)發(fā)作超過2 次以上)及不能耐受激素副作用而難以繼續(xù)用藥的腎病綜合征[1]。環(huán)磷酰胺(Cytoxan，CTX)是治療小兒RNS最有效的藥物之一，由于其對(duì)性腺的毒性作用，尤其對(duì)男性精原細(xì)胞的影響，限制了該藥在臨床上的廣泛應(yīng)用。我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在研究中藥補(bǔ)腎健脾方與CTX合用對(duì)大鼠性腺的影響，為今后臨床應(yīng)用CTX治療腎病時(shí)，減輕其對(duì)性腺的損害提供一定的用藥經(jīng)驗(yàn)和佐證。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原交系健康雄性Wistar大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量160～190 g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)。

1.1.2主要試劑與儀器 血清睪丸酮(Ts)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)放免測(cè)定試劑盒，購(gòu)于天津得普生物科學(xué)公司(批號(hào) 980811)。DDL-5冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，速度：4000轉(zhuǎn)，時(shí)間：10 min)，GMJ型全自動(dòng)放射免疫γ計(jì)數(shù)器(江蘇醫(yī)療電子研究所)。

1.1.3試驗(yàn)藥品 鹽酸阿霉素(ADR針劑)10 mg/支(批號(hào) 0303E1，深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；0.9%生理鹽水10 ml/支(批號(hào) 030519)；CTX200 mg/支(批號(hào) 030404，上海華聯(lián)制藥有限公司)；潑尼松5 mg/片(批號(hào) 0304021，山東新華制藥股份有限公司)；4%異戊巴比妥鈉(批號(hào) 860122，union進(jìn)口分裝，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠)；中藥補(bǔ)腎健脾方水煎液(成分：黃芪12 g，淫羊藿10 g，白術(shù)12 g，巴戟天10 g，肉蓯蓉10 g，菟絲子10 g，當(dāng)歸12 g，枸杞子15 g，陳皮10 g，五味子6 g)經(jīng)煎煮、過濾，制成100%水煎劑，1 ml藥液約含1 g生藥。以上藥品均購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組40只Wistar雄性大白鼠隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、CTX組、CTX+中藥組，每組10只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)造模 除空白對(duì)照組外，余3組建立NS動(dòng)物模型。大鼠非麻醉下以ADR 6.2mg/kg量，尾靜脈一次注射性造模(臨用時(shí)ADR用注射用水配成2 mg/ml的溶液)[2]?？瞻讓?duì)照組注射等量的生理鹽水。注射后將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中，自由攝食飲水，并于注射后第7、8、9天開始記錄尿蛋白定性情況，當(dāng)尿蛋白定性≥ +++，并持續(xù)3 d以上者，即為模型制作成功。四組動(dòng)物共死亡5只，其中CTX組1只因尾部嚴(yán)重感染于治療后第5天死亡；CTX+中藥組因灌胃不當(dāng)，窒息死亡2只；模型對(duì)照組因未做治療，于造模成功后第4天尾部嚴(yán)重感染死亡1只，第15天不明原因死亡1只，考慮可能與ADR和CTX均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性有關(guān)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法造模成功后，4組均正常飲食。CTX組和CTX+中藥組腹腔注射CTX，每次20 mg/kg，隔日1次，一周3次，共12次。其總量相當(dāng)于臨床患兒的用藥總量，平均每天用量(10 mg/kg)相當(dāng)于臨床用量(2～3 mg/kg·d)的3～5倍。CTX+中藥組除CTX用法同上外，再予中藥補(bǔ)腎健脾方煎劑每日灌胃10ml/kg。兩組均每日灌服潑尼松5 mg/kg，晨起頓服，每天1次，連續(xù)4周。(CTX組和CTX+中藥組均需每周稱重以隨時(shí)調(diào)整用藥劑量)，給藥劑量按《中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)方法》提供的常用動(dòng)物與人的不同體質(zhì)量的藥物換算公式計(jì)算。(公式：D1：D2=R1：R2，D2=D1×D2÷R1? D2為所求劑量，D1為已知?jiǎng)┝浚琑1為相應(yīng)已知值，R2為與待求劑量D2相應(yīng)動(dòng)物體表面積換算比值)。實(shí)驗(yàn)期間每周記錄一次動(dòng)物的一般情況，并于造模前、造模后1周和用藥4周后單個(gè)地置于代謝籠，禁食1天，收集24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白定量。于用藥4周后全部動(dòng)物先用4%異戊巴比妥鈉按4 mg/kg麻醉，行腹主動(dòng)脈取血，大約5 ml。送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血生化和性激素。Ts、FSH、LH，用放射免疫方法測(cè)定含量，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)室協(xié)助測(cè)定。取大鼠腎組織與睪丸，測(cè)定其重量，冷凍制病理切片鏡下觀察。

1.2.4實(shí)驗(yàn)觀察一般情況(大鼠飲食、體質(zhì)量、尿量、水腫狀況、毛澤、活動(dòng)性、存活率等)，用藥前后大鼠體質(zhì)量的變化，用藥前后大鼠24 h尿蛋白定量的變化，用藥前后各組大鼠血生化比較，用藥前后各組大鼠Ts、FSH、LH含量比較，用藥前后各組大鼠性腺重量變化，以及用藥前后各組大鼠腎臟與睪丸光鏡下的病理學(xué)變化。

2結(jié)果

2.1一般觀察模型組食量明顯減少，尿量減少，并出現(xiàn)明顯浮腫，精神萎靡，倦怠少動(dòng)，消瘦，皮毛無光澤，并有豎毛、脫毛現(xiàn)象。兩個(gè)治療組的動(dòng)物在用藥后，上述表現(xiàn)明顯改善，尤以CTX+中藥組改善明顯。

2.2各組大鼠體質(zhì)量變化比較見表1。

表1　各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g，±s)

表1　各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g，±s)

空白對(duì)照組模型對(duì)照組CTX組CTX+中藥組n10898造摸前175.91±7.63183.82±1.63176.92±4.65179.84±9.33用藥4周后230.56±4.39*160.13±3.49199.29±6.65*229.77±2.81**

與模型對(duì)照組比較*P﹤0.05，與CTX組比較**P﹤0.05。

表1顯示 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P﹥0.05)。用藥4周后CTX+中藥組和CTX組大鼠體重明顯高于模型對(duì)照組，有顯著性差異(P﹤0.05)，CTX+中藥組大鼠體重高于CTX組，有顯著性差異(P﹤0.05)。

2.3用藥前后大鼠24 h 尿蛋白定量的變化見表2。

表2　用藥前后大鼠24 h 尿蛋白定量的變化(mg/24h，±s)

表2　用藥前后大鼠24 h 尿蛋白定量的變化(mg/24h，±s)

空白對(duì)照組模型對(duì)照組CTX組CTX+中藥組n10989造模前8.17±1.937.69±1.388.37±2.637.91±1.95造模后第1周7.91±0.48184.06±5.35*186.43±4.80*179.59±4.87*用藥4周后8.04±0.50*191.76±7.6059.39±10.11*33.25±6.73**

與模型對(duì)照組比較*P﹤0.05，與CTX組比較**P﹤0.05。

表2顯示造模前各組大鼠尿蛋白無明顯差異(P﹥0.05)。造模后1周，除空白對(duì)照組外，余三組尿蛋白均升高，且與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P﹤0.05)，組間無差別(P﹥0.05)。用藥4周后，CTX組和CTX+中藥組尿蛋白都有所降低，與模型對(duì)照組相比均有顯著差異(P﹤0.05)，CTX+中藥組尿蛋白水平低于CTX組，有顯著性差異(P﹤0.05)。

2.4用藥4周后大鼠血生化比較見表3。

表3　用藥4周后大鼠血生化比較 (±s)

表3　用藥4周后大鼠血生化比較 (±s)

空白對(duì)照組模型對(duì)照組CTX組CTX+中藥組n10898Tp(g/l)64.47±6.87*47.08±5.0755.73±6.81*62.33±3.09**Alb(g/l)28.60±3.80*20.32±3.4723.97±2.15*27.55±3.42**Ch(mmol/l)3.83±0.32*6.56±0.335.04±0.55*3.81±0.40**TG(mmol/l)1.13±0.17*2.31±0.171.70±0.06*1.25±0.13**BUN(mmol/l)5.93±0.505.81±0.906.23±1.305.61±0.60Cr(mmol/l)61.7±4.9063.1±5.6066.9±4.3063.4±2.70

與模型對(duì)照組比較*P﹤0.05，與CTX組比較**P﹤0.05

表3顯示 用藥4周后，CTX組、CTX+中藥組與模型對(duì)照組相比總蛋白(Tp)、白蛋白(Alb)有顯著升高(P﹤0.05)，膽固醇(Ch)、甘油三酯(TG)有顯著降低(P﹤0.05)，且兩組間有比較均有顯著差異(P﹤0.05)。尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)：各組間無明顯差別(P﹥0.05)。

2.5用藥4周后大鼠性激素定量的變化見表4。

表4　用藥4周后大鼠性激素定量的變化　(±S)

表4　用藥4周后大鼠性激素定量的變化　(±S)

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組CTX組CTX+中藥組n10898Ts(ng/24h)1.98±0.062.11±0.301.04±0.32*1.78±0.14**LH(IU/24h)5.23±0.654.90±0.747.86±0.64*5.69±0.29**FSH(IU/24h)3.98±0.623.94±0.577.01±1.00*4.66±0.59**

與模型對(duì)照組比較*P﹤0.05，與CTX組比較**P﹤0.05

表4顯示用藥4周后，CTX組、CTX+中藥組與模型對(duì)照組相比Ts有顯著降低，LH 、FSH 有顯著升高(P﹤0.05)。并且，CTX+中藥組與CTX組相比Ts含量有明顯升高，LH 、FSH 有顯著降低，均有顯著性差異(P﹤0.05)。

2.6用藥4周后各組大鼠性腺重量比較見表5

表5　用藥4周后各組大鼠性腺重量比較(g，±s)

表5　用藥4周后各組大鼠性腺重量比較(g，±s)

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組CTX組CTX+中藥組n10898睪丸重量0.219±0.040.217±0.0390.219±0.0530.265±0.043

與模型對(duì)照組比較*P﹤0.05，與CTX組比較**P﹤0.05

表5顯示：用藥4周后，CTX+中藥組睪丸重量比CTX組有明顯升高，有顯著性差異(*P﹤0.05)，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。CTX組與空白對(duì)照組相比睪丸重量無明顯差異(P﹥0.05)。

2.7腎組織病理學(xué)觀察

光鏡下HE染色觀察腎標(biāo)本，空白對(duì)照組大鼠腎小球輪廓清楚，無任何異常。模型對(duì)照組大鼠腎小球輪廓大致清楚，未見明顯改變，但多個(gè)腎小管內(nèi)可見蛋白管型，腎間質(zhì)充血明顯。CTX組腎小球基本正常，腎小管內(nèi)有蛋白管型，腎間質(zhì)充血不明顯。CTX+中藥組腎小球未見異常，腎小管內(nèi)偶見管型，腎間質(zhì)改變不明顯。

2.8睪丸切片病理學(xué)觀察

高倍鏡下，空白對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)可見各級(jí)生精細(xì)胞及支持細(xì)胞，精原細(xì)胞及各級(jí)精母細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，可見大量精子，見圖1。模型對(duì)照組組大鼠睪丸未見明顯改變，基本同正常組，見圖2。CTX組大鼠睪丸的曲細(xì)精管生精上皮細(xì)胞排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，精子細(xì)胞及精子不易見到，見圖3。CTX+中藥組大鼠睪丸損傷較輕，曲細(xì)精管內(nèi)可見各級(jí)生精細(xì)胞，結(jié)構(gòu)清楚，精子細(xì)胞及精子較正常組略減少，見圖4。

圖1　空白對(duì)照組大鼠睪丸病理切片(HE×100)

圖2　模型對(duì)照組大鼠睪丸病理切片(HE×100)

圖3　CTX組大鼠睪丸病理切片(HE×100)

圖4　CTX+中藥組大鼠睪丸病理切片(HE×100)

3討論

“腎病綜合征”在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并無此病名記載，但從其臨床表現(xiàn)上來看，它散在的記載于“水腫”、“精微下漏”、“癃閉”、“關(guān)格”、“虛損”等病證中。小兒腎病綜合征的根本病機(jī)為“脾腎虧虛”，臨床多見脾虛濕困，腎陽虛損，病性屬虛中夾實(shí)，補(bǔ)腎健脾方切合病機(jī)，以扶正為主，祛邪為輔，治以補(bǔ)氣健脾，溫腎壯陽，補(bǔ)血固精，利水消腫。使陰陽互補(bǔ)，氣血相生，補(bǔ)瀉并施，散斂兼顧。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥補(bǔ)腎健脾方可明顯提升大鼠體重，升高血清Tp和Alb，降低Ch和TG含量，降低大鼠蛋白尿，從而改善“腎病綜合征”的臨床表現(xiàn)；此外，補(bǔ)腎健脾方和CTX聯(lián)合使用與單獨(dú)使用CTX相比，含補(bǔ)腎健脾方組大鼠的Ts含量明顯高于CTX組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，同時(shí)具有降低FSH、LH含量，而且含補(bǔ)腎健脾方組的睪丸重量明顯高于其他各組，說明補(bǔ)腎健脾方可明顯改善雄性大鼠性腺功能。 CTX+中藥組與CTX組的Ts、FSH、LH相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。說明補(bǔ)腎健脾方和CTX聯(lián)用可以調(diào)節(jié)性激素水平趨向正常的作用。且CTX+中藥組大鼠睪丸較CTX組在光鏡下病理切片損傷較輕，說明中藥補(bǔ)腎健脾方具有保護(hù)睪丸組織結(jié)構(gòu)，維護(hù)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。

結(jié)合有關(guān)資料分析認(rèn)為[3][4]，補(bǔ)腎健脾方可以保護(hù)和促進(jìn)生殖機(jī)能，并可能通過促進(jìn)對(duì)下丘腦—垂體—性腺軸的組織形態(tài)學(xué)改變和調(diào)節(jié)其內(nèi)分泌，以及抗氧化、清除自由基的作用來發(fā)揮對(duì)抗或減弱CTX造成的性腺損害。因此，通過調(diào)節(jié)Ts、FSH、LH的平衡而防治CTX所致的性腺損害，可以被認(rèn)為是中藥補(bǔ)腎健脾方的作用機(jī)理之一，為臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。但由于各方原因我們的研究還不夠深入，還不能從分子及基因角度來闡述補(bǔ)腎健脾方改善腎病綜合征臨床癥狀的機(jī)制，以及保護(hù)性腺功能及維持睪丸組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具體原理，這將是我們下一步的研究目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳江華,李夏玉.難治性腎病綜合征免疫抑制治療的臨床挑戰(zhàn).現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2012,24(5):483~485.

[2]單次尾靜脈注射法阿霉素大鼠腎病模型的建立.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,21(1):4.

[3]補(bǔ)腎健脾法對(duì)卵巢功能圍早衰患者卵巢儲(chǔ)備功能影響的臨床研究,中國(guó)臨床研究,2013,26(1):73-74.

[4]補(bǔ)腎健脾方對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸功能的影響,中醫(yī)研究,2010,23(1):28-29.

王靜，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)兒科。

作者簡(jiǎn)介：王靜(1977—)，女，山東青島人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事臨床中醫(yī)兒科工作。

中圖分類號(hào)：R692

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2015)04-0384-04

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.008

(收稿日期2015-1-10)

Effects of spleen-kidney reinforcing formula on the sexual glands and related pathological structures of experimental rats with nephrotic syndrome

WANGjingWANGJuan

(Hai Ci Medical Group of Qingdao,Qingdao 266033，China)

Abstract：Objective: To explore the effective mechanism of kidney-spleen reinforcing formula (Bu Shen Jian Pi Fang) on the sexual glands and hormones as well as related pathological structures of rats with nephrotic syndrome. Methods: Experimental rats with nephrotic syndrome were created by tail vein injection of Doxorubicin hydrochloride. The effects on the sexual hormones of these rats exerted by single application of Cyclophosphamide (CTX) and combined application of CTX and kidney-spleen reinforcing formula were observed respectively. Pathological changes of the kidney tissue slice and testicle slice were observed. Results: Compared to the group treated by using CTX alone, the group treated by the combined therapy had obviously higher level of serum testosterone (Ts). In addition, the combined therapy was able to bring down follicle-stimulating hormone (FSH) and LH. The two groups had significant differences (P<0.05) in all the above indexes. Both of the two groups were able to regulate the sexual hormone level to normal and there was no significant pathological change of the testicle tissue slice. Conclusions: Kidney-spleen reinforcing formula can protect and promote the reproductive function and relieve or counteract the CTX toxicity on sexual glands by regulating endocrines and obliterating free radicals possibly through the histomorphological changes of hypothalamus-pituitary-gonad axis.

Key words：nephrotic syndrome； kidney-spleen reinforcing formula； CTX； sexual gland；rats