劉松，汪明星，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

堿性果膠酶(PGL，E.C.4.2.2.2)是一種在堿性環(huán)境下具有高活性的一類果膠裂解酶，可以通過(guò)反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的α-1，4-糖苷鍵并釋放出不飽和的寡聚半乳糖醛酸［1］?；谄浯呋匦?，PGL主要應(yīng)用于紡織工業(yè)中的織物精煉過(guò)程。傳統(tǒng)的精煉工藝是在高溫強(qiáng)堿環(huán)境下去除織物中的果膠，該工藝能耗高，且廢液對(duì)環(huán)境污染極大。在生物精煉工藝中，PGL可以高效去除織物中的果膠，節(jié)能減排效果明顯［1］。此外，PGL還廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和造紙行業(yè)，如降解橄欖中的果膠提高出油率［2］、通過(guò)分解陰離子多糖果膠提高紙漿質(zhì)量［3］。

復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境如紡織精煉等對(duì)PGL在高溫條件下的穩(wěn)定性和催化活性提出了更高的要求［2］。目前主要通過(guò)菌株選育來(lái)獲得高熱穩(wěn)定性的PGL，主要來(lái)源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)［4］、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)［5］和部分芽孢桿菌［6］等。然而，已發(fā)現(xiàn)的耐熱酶比酶活為9.9 ～35 U/mg［4-6］，遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用需求。此外，由于缺乏野生菌PGL高效發(fā)酵策略，這些來(lái)源的熱穩(wěn)定PGL難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，提高已實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的重組PGL的熱穩(wěn)定性和催化活性，具有重要應(yīng)用前景和現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，基于蛋白質(zhì)工程的方法已廣泛用于酶催化性能的改造。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)突變、隨機(jī)突變和飽和突變等，高度依賴于酶分子晶體結(jié)構(gòu)分析或建立高通量的突變體篩選平臺(tái)［7］。這些局限性使得研究者難以在短時(shí)間內(nèi)獲得理想的酶突變體。作者在前期工作中，首次發(fā)現(xiàn)N-端融合釀酒酵母Zuotin蛋白［8］等來(lái)源的6種自組裝雙親短肽(SAP)，使脂肪氧合酶的55℃半衰期提高2.3～4.5倍，同時(shí)其比酶活亦顯著提升［9］。該分子改造策略一個(gè)顯著特點(diǎn)是，無(wú)需深入了解酶分子的結(jié)構(gòu)信息和建立高通量篩選平臺(tái)，較傳統(tǒng)技術(shù)更高效。目前，這種融合SAP的分子改造技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶［10］、腈水合酶［11］和堿性淀粉酶［12］等酶的熱穩(wěn)定性或催化活性改造。

在前期研究中，作者將Bacillus sp.WSHB04-02 PGL成功能表達(dá)于畢赤酵母，PGL產(chǎn)量達(dá)到1 593 U/mL［13］。為進(jìn)一步提高酶的熱穩(wěn)定性，將6種SAP融合至Bacillus PGL的N-端，獲得了熱穩(wěn)定性和比酶活均有提高的PGL。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

E.coli JM109，E.coli BL21(DE3)，Bacillus sp.WSHB04-02和pET-22b(+)均為本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Nco I、Nde I和Xho I均購(gòu)自Ther-mo公司，DNA定點(diǎn)突變?cè)噭┖蠱utanBEST Kit、Primer star DNA聚合酶、膠回收試劑盒、DNA連接酶、感受態(tài)制備試劑盒和瓊脂糖均購(gòu)于TaKaRa公司。異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、質(zhì)粒提取試劑盒與氨芐青霉素均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;胰蛋白胨與酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司;NuPAGE?Novex? Bis-Tris預(yù)制凝膠購(gòu)自Life Technologies公司;考馬斯亮藍(lán)染色液G250/R250和標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;聚半乳糖醛酸(PGA)購(gòu)自Sigma公司;其他常規(guī)試劑均為分析純，都是進(jìn)口分裝或者國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。TB培養(yǎng)基:酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PGL與SAP融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

6個(gè)SAP的編碼基因由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，并分別在其5’端和3’端引入6×Histag和PT linker基因。將帶有融合標(biāo)簽和PT linker的短肽DNA克隆至質(zhì)粒pET-22b(+)的Nde I和Nco I位點(diǎn)之間，得到含SAP的表達(dá)質(zhì)粒，pET-22b(+)/S1，pET-22b(+)/S2，pET-22b(+)/S3，pET-22b(+)/S4，pET-22b(+)/S5和pET-22b(+)/S6。利用引物P1和P2(表2)經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的Bacillus sp.WSHB04-02 PGL基因，分別克隆至上述含SAP表達(dá)載體的Nco I和Xho I，得到PGL與SAP融合表達(dá)的載體。

表1 SAP氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 1 Amino acid sequences and characteristics of SAPs

表2 PGL基因擴(kuò)增引物序列Table 2 Primer sequences for PGL gene amplification

1.2.2 重組菌發(fā)酵

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)得到表達(dá)PGL融合酶的重組菌。

種子培養(yǎng):將重組菌接種于LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素，2%葡萄糖)，于37℃、200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10 h。

搖瓶發(fā)酵:種子液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接入TB培養(yǎng)基(100 μg/mL氨芐青霉素)，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體濃度OD600=0.6，加入終濃度0.04 mmol/L IPTG于30℃下誘導(dǎo)48 h。

1.2.3 PGL的純化

取發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，獲得含PGL的發(fā)酵上清液。將上清液置于冰上，緩慢加入硫酸銨粉末，至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.9%，離心收集上清液。將樣品用0.25 μmol/L微孔濾膜過(guò)濾，所得樣品用5 mL苯基疏水柱(HiTrapTMPhenyl FF，GE)進(jìn)行純化。柱純化條件如下:用5～10倍柱體積的緩沖液A(20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.9%硫酸銨，pH 7.5)平衡疏水柱，之后以1 mL/min的流速進(jìn)樣;進(jìn)樣結(jié)束，用5個(gè)柱體積的A液繼續(xù)沖平柱子;流速改為3 mL/min，分別以0～100%的洗脫緩沖液B(20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 7.5)進(jìn)行線性洗脫。取測(cè)得PGL酶活的洗脫液在20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 7.5)中過(guò)夜透析，4℃保存。

1.2.4 PGL酶活測(cè)定

PGL酶活測(cè)定體系:含0.2%PGA的甘氨酸-NaOH 緩沖液(0.2 mol/L，0.44 mmol/L 的 CaCl2，pH 9.4)2 mL，待測(cè)樣品20 μL，無(wú)活性的酶液為空白對(duì)照。PGL酶活測(cè)定條件:將反應(yīng)體系置于45℃下水浴15 min，用3 mL磷酸溶液(0.03 mol/L)終止反應(yīng)，在235 nm處測(cè)定吸光度值。PGL酶活單位定義:單位時(shí)間裂解PGA產(chǎn)生1 μmol/L不飽和PGA所用的酶量。計(jì)算方法如下:

式中:PGL酶活力單位為U/mL;b，比色皿厚度，cm;4 600，不飽和PGA于235 nm處的摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm);t，酶促反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

采用 Life Technologies公司預(yù)制膠 NuPAGE?Novex? Bis-Tris，具體操作方法見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)。使用濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，以0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.2.6 蛋白濃度測(cè)定

采用碧云天的Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，具體操作詳見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)?；诩兠傅牡鞍诐舛群兔富睿瑴y(cè)定PGL及SAP-PGL融合酶的比酶活。

1.2.7 PGL最適反應(yīng)溫度與半衰期的測(cè)定

重組 PGL 及突變體在45、50、55、60、65 和 70 ℃進(jìn)行酶催化反應(yīng)，測(cè)PGL在不同溫度條件下的酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。

重組PGL及突變體的熱穩(wěn)定性用55℃下酶活力半衰期(t1/2，min)來(lái)表示。將純化后的PGL用20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 7.5)稀釋至100 μg/mL，并在55℃保溫，間隔測(cè)定殘余酶活，將殘余酶活按照文獻(xiàn)所述方式擬合并計(jì)算t1/2［14］。

1.2.8 PGL最適反應(yīng)pH的測(cè)定

在不同pH下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以處理前酶活定為100%。按2.2.4所示方法，將反應(yīng)pH調(diào)為8.6～10.6不等的5個(gè)梯度，30℃下保溫24 h，測(cè)PGL在不同pH條件下的酶活力，考察其最適反應(yīng)pH。

1.2.9 PGL催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在0.05～2 g/L不等的PGA濃度下，按照2.2.4所示方法測(cè)定不同底物濃度下的酶活，并由Graph-Pad Prism 5計(jì)算得到Km和kcat。

1.2.10 PGL結(jié)構(gòu)分析

利用PIC在線服務(wù)器(http://pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html)計(jì)算SAP及SAP-PGL氫鍵作用、鹽橋數(shù)量、疏水作用等。

2 結(jié)果與討論

2.1 SAP-PGL融合酶的制備

SAP是一類由親疏水性氨基酸殘基交替排列而成的短肽，它能在特定條件下自發(fā)組裝成有序的納米結(jié)構(gòu)。本研究選取了6種SAP用于制備SAP-PGL融合酶(表1)。其中，SAP-1和SAP-2分別源自Zuotin蛋 白［15］和 Carnobacterium maltaromaticum CP5［16］，SAP-3、SAP-4、SAP5 和 SAP6 由 Lazar等設(shè)計(jì)［17］。為避免PGL主體結(jié)構(gòu)受SAP的影響而喪失催化活性，本研究利用最常用的蛋白質(zhì)linker—PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPT)將SAP連接至Bacillus PGL的N-端，并在SAP的N-端融合親合純化標(biāo)簽His-tag以便進(jìn)行親和純化(圖1)。將構(gòu)建得到的6種融合酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達(dá)。SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4、SAP-5和 SAP-6 與 LOX 融合分別得到融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL。

圖1 SAP-LOX融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the SAP-PGL fusion plasmids

取含有融合酶的發(fā)酵上清液進(jìn)行分離純化。盡管融合酶N-端含有His-Tag，但是除S1-PGL之外的其他5種融合酶與Ni2+親和層析柱的結(jié)合效率低，無(wú)法進(jìn)行親和純化。這可能是由于5種融合酶的His-Tag被包埋于酶蛋白分子內(nèi)部而無(wú)法與Ni2+親和層析柱有效作用［9］。因此，采用苯基疏水柱對(duì)融合酶進(jìn)行純化。在線性洗脫條件下，天然酶PGL在30%～40%無(wú)鹽緩沖液中被洗脫，而SAP-PGL融合酶則在50%～70%無(wú)鹽緩沖液被洗脫。這些現(xiàn)象表明，PGL在融合SAP表面疏水度進(jìn)一步增強(qiáng)。上述含酶的洗脫液經(jīng)過(guò)夜透析得到電泳純樣品(圖2)。

圖2 SAP-PGL融合酶的SDS-PAGE蛋白電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified SAP-PGL fusions

2.2 融合SAP對(duì)PGL熱穩(wěn)定性的影響

為比較PGL與SAP-PGL的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了純化后的PGL及SAP-PGL融合酶55℃半衰期t1/2(表3)。結(jié)果顯示，融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL 和 S6-PGL 分別較 PGL t1/2提高 16、43、72、15、23和9倍。其中，S3-PGL的55℃ t1/2達(dá)到21.53 h，表現(xiàn)出極高的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，除S2-PGL之外，其他5種SAP-PGL的最適反應(yīng)溫度均較PGL提高5℃。目前，關(guān)于分子改造提高PGL熱穩(wěn)定性的報(bào)道較少。Xiao等［18］采用一種基于熔解溫度導(dǎo)向型的序列比對(duì)(Melting-Temperature-Guided Sequence Alignment)的定點(diǎn)突變策略，得到的黃單胞菌(Xanthomonas campestris)PGL突變體R236F在45℃的t1/2達(dá)到21.25 h，較野生酶提高23倍。很顯然，本研究得到S3-PGL較X.campestris PGL突變體R236F具有更高的熱穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明，融合SAP能顯著提高PGL的熱穩(wěn)定性。

表3 SAP-PGL融合酶的55℃半衰期與最適反應(yīng)溫度Table 3 The t1/2values of SAP-PGL fusions at 55℃

2.3 融合SAP對(duì)PGL催化活性的影響

為進(jìn)一步分析融合SAP對(duì)PGL催化活性的影響，以PGA為底物測(cè)定了SAP-PGL融合酶的催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)和比酶活，結(jié)果如表4所示。與PGL相比，SAP-PGL融合酶的Km均略有提高，表明融合SAP降低了PGL與底物PGA的親和力。S1-PGL、S2-PGL和S5-PGL的kcat較SAP提高超過(guò)50%，其他融合酶kcat增加不明顯或有所下降。與SAP相比，S1-PGL的kcat/Km和比酶活分別提高3.52倍和2.56倍，表明融合SAP-1提高了PGL底物專一性和催化效率。然而，其余5種融合酶的kcat/Km和比酶活均顯著下降。目前，從自然界篩選得到的高熱穩(wěn)定性PGL中，如B.licheniformis［4］、Bacillus sp strain P-4-N［6］和 T.maritime MSB8［5］等，比酶活僅為9.9 ～35 U/mg，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用價(jià)值。盡管Xiao等［18］通過(guò)分子改造提高了PGL的熱穩(wěn)定性，但其比酶活未見(jiàn)顯著增長(zhǎng)，僅為208 U/mg。本研究獲得的S1-PGL t1/2(55℃)和比酶活分別達(dá)到6.16 h和458.52 U/mg，具有理想的應(yīng)用性能。

表4 突變體酶學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic constants of SAP-PGL fusions

2.4 融合SAP對(duì)PGL最適反應(yīng)pH的影響

PGL主要用于織物前處理等堿性應(yīng)用環(huán)境，故分析了SAP-PGL的最適反應(yīng)pH。將突變體分別置于pH 9.0～10.6的4種緩沖液中，測(cè)定其反應(yīng)活性。如圖3所示，S1-PGL、S2-PGL和S3-PGL與PGL的最適反應(yīng)pH一致，S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL最適反應(yīng)pH提升至10.6(圖3)。因此，所有SAP-PGL融合酶最適反應(yīng)pH均在堿性范圍內(nèi)，符合其工業(yè)應(yīng)用環(huán)境要求。

圖3 pH對(duì)SAP-PGL催化活性的影響Fig.3 The effect of pH on the activities of SAP-PGL fusions

2.5 融合SAP提高PGL熱穩(wěn)定性和催化活性的機(jī)制

一般認(rèn)為，短肽融合提高酶分子穩(wěn)定性的機(jī)制主要有兩種:分子局部剛性的增加［19］和酶分子的寡聚化作用［9］。Takano等發(fā)現(xiàn) C-端短肽(IGCIILT)主要通過(guò)增加氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用增強(qiáng)S.tokodaii RNase HI C-端剛性［19］。前期研究中，作者通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射分析觀察到融合SAP使脂肪氧合酶的粒徑增加，表明融合酶存在一定的寡聚化，而寡聚化是多亞基蛋白穩(wěn)定化的重要方式［20］。在凝膠過(guò)濾色譜分析過(guò)程中，未能見(jiàn)到SAP-PGL多聚體分子的出現(xiàn)(結(jié)果未顯示)，表明SAP-PGL不是通過(guò)寡聚化作用來(lái)獲得高熱穩(wěn)定性的。本研究利用PIC在線服務(wù)器分析了SAP-PGL融合酶分子內(nèi)作用力變化(表5)。結(jié)果顯示，除S6-PGL之外，各融合酶中的疏水相互作用有一定程度增加。此外，S1-PGL、S2-PGL、S5-PGL和S6-PGL分子中的氫鍵較PGL增加3個(gè)、3個(gè)、2和5個(gè)。因此，分子內(nèi)作用的增加可能是SAP-PGL融合酶熱穩(wěn)定提高的重要原因。SAP-3、SAP-5和SAP-6是由不同linker連接兩個(gè)相同SAP序列得到的短肽(表1)，短肽柔性依次提高［9］。如表3所示，S3-PGL、S5-PGL和S6-PGL的熱穩(wěn)定性依次下降，表明高柔性的SAP不利于酶熱穩(wěn)定性的提高。

與PGL相比，僅有S1-PGL的比酶活顯著提高，其他融合酶的比酶活則明顯下降。融合短肽的長(zhǎng)度可能是影響其催化活性的重要原因之一。如表1所示，雙親短肽SAP-1由16個(gè)氨基酸殘基組成，而其他5條 SAP的氨基酸殘基分別超過(guò)40個(gè)［9］。因此，SAP-1融合至PGL后可能形成的空間位阻相對(duì)較少，對(duì)底物和產(chǎn)物出入酶催化活性中心的影響較小，融合較長(zhǎng)短肽則造成較大的影響。S1-PGL的kcat明顯高于PGL及其他融合酶，而其Km并未在較水平。這表明S1-PGL比酶活的提高主要是由于底物轉(zhuǎn)換數(shù)的增加。關(guān)于S1-PGL比酶活提高的機(jī)制還有待其晶體結(jié)構(gòu)的解析。

表5 PGL及其SAP-PGL融合酶分子內(nèi)作用力分析Table 5 Interactions potentially involved in the stability of PGL and SAP-PGL fusions

3 結(jié)束語(yǔ)

關(guān)于 PGL高效生產(chǎn)已有大量報(bào)道，芽孢桿菌［21-22］和畢赤酵母［13］等是主要的生產(chǎn)菌株。然而，PGL應(yīng)用性能(如熱穩(wěn)定性、催化活性等)優(yōu)化方面的研究較少，對(duì)其應(yīng)用的推廣造成不利影響。為提高PGL熱穩(wěn)定性，本研究考察了N-端融合自組裝雙親短肽(SAP)對(duì)PGL熱穩(wěn)定性的影響。將6種具有不同疏水性和柔性的SAP融合至Bacillus sp.WSHB04-02 PGL N-端，得到融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL。與 PGL相比，融合酶的55℃半衰期(t1/2)提高9.69～72.03倍。其中，PGLS1比酶活達(dá)458.52 U/mL，較PGL提高1.5倍;其他融合酶比酶活則較PGL下降38.27% ～93.94%。上述結(jié)果表明，N-端融合SAP能有效提高PGL熱穩(wěn)定性和催化活性。本研究得到的具有高熱穩(wěn)定性和高催化活性S1-PGL具有突出的應(yīng)用前景。然而，末端融合SAP提高酶分子穩(wěn)定性的機(jī)制尚無(wú)明確結(jié)論和直接證據(jù)。在下一步工作中，將通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)解析揭示S1-PGL穩(wěn)定化的分子機(jī)制，為基于融合SAP的酶分子改造策略的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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