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      響應(yīng)面優(yōu)化大孔吸附樹脂分離純化茼蒿總黃酮*

      2015-12-25 02:01:30陳建中葛水蓮昝立峰王更先邢浩春付靜
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2015年11期
      關(guān)鍵詞:茼蒿大孔黃酮

      陳建中,葛水蓮,昝立峰,王更先,邢浩春,付靜

      1(邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北邯鄲,056005)2(冀南太行山區(qū)野生資源植物研發(fā)中心,河北邯鄲,056005)

      研究表明,黃酮類物質(zhì)具有抗癌、抗病毒,調(diào)節(jié)免疫力、治療心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松和糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性藥用作用[1-2]。茼蒿(Chrysanthemum coronarium L.)又名蓬蒿,是菊科茼蒿屬1年或2年生草本植物。其莖葉可作為蔬菜食用,亦可入藥?!吨兴幋筠o典》記載,茼蒿有“和脾胃、消痰飲、安心神”之功效,性味甘、辛、平,無毒,清利頭目,利小便[3]。

      大孔吸附樹脂具有比表面積較大、吸附純化效率高、物理吸附污染低、溫度穩(wěn)定性高等特點[4-5]。因而近幾年在中草藥有效成分提取和天然產(chǎn)物的分離純化中被廣泛應(yīng)用[6-7]。有關(guān)茼蒿總黃酮(TFC)純化工藝的研究并不多見,試驗以TFC的吸附量和回收率為指標(biāo),通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗考察5種大孔吸附樹脂對TFC的靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸附性能,以篩選大孔樹脂純化TFC的最佳工藝。

      1 材料方法

      1.1 材料試劑儀器

      材料:茼蒿于開花前采集地上部分,采時株高多20~40 cm,為冀南太行山區(qū)野生種類,采集地上部分。材料去掉雜質(zhì)、洗凈塵土、瀝干水分,再于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重,粉碎過40目篩后備用。

      試劑:無水乙醇、蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均為分析純。

      試驗儀器及設(shè)備:小型自動粉碎機(鄭州市烽火機械設(shè)備有限公司),L5紫外可見分光光度計(日本島津儀器公司),N-1100V-WP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安安泰儀器公司)。

      1.2 標(biāo)曲繪制與TFC濃度測定

      標(biāo)曲繪制:參考江敏[8]、田徽[9]等人的方法,根據(jù)試驗數(shù)據(jù)得出,吸光度(Y)和濃度(X)的回歸方程:Y=9.12X-0.023,R2=0.998 6,線性回歸關(guān)系良好。黃酮含量測定:吸取樣品液1 mL,用體積分數(shù)(下同)70%乙醇補至5 mL,加入質(zhì)量分數(shù) 5%NaNO20.3 mL,搖勻置6 min;再加入質(zhì)量分數(shù)10%Al(NO3)30.3 mL,搖勻置6 min;加質(zhì)量分數(shù)4%NaOH 4 mL,用蒸餾水定容至10 mL,搖勻15 min后測定吸光度,重復(fù)3次求均值[10]。

      1.3 大孔吸附樹脂靜態(tài)分離純化試驗

      1.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

      取樹脂適量,95%乙醇完全浸泡24 h,去除大孔樹脂碎片及雜物。采用濕法裝柱,用95%乙醇反復(fù)洗滌,直至水與流出液不產(chǎn)生白色渾濁,再用蒸餾水洗至無醇味;接著先后用體積分數(shù)5%的HCl與質(zhì)量分數(shù)2%的NaOH反復(fù)淋洗,并靜止置2~4 h后,用蒸餾水洗至pH值中性,浸泡于蒸餾水中備用。

      1.3.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附-解吸性能試驗

      在25℃下精確稱取經(jīng)預(yù)處理的5種大孔樹脂5.00 g,分別置于250 mL磨口三角錐形瓶中,精密加入濃度2.56 mg/mL的 TFC100 mL,每隔15 min振搖20 s持續(xù)2 h,使其充分吸附至吸附平衡,精密移取剩余樣液適量測定其吸光度值,計算吸附前后黃酮質(zhì)量濃度的變化;將吸附至飽和狀態(tài)的樹脂另置于250 mL錐形瓶中,精密加入95%乙醇50 mL,每隔10 min振搖20 s,振搖2 h,精密吸取上層液測定吸光度值,計算各樹脂的吸附量,解吸附率和回收率。

      吸附量/(mg·g-1)=(c0-c1)V/M

      吸附率/%= [(c0-c1)/c0]×100

      解吸率/%=[c2/(c0-c1)]×100

      回收率/%=(c2/c0)×100

      式中:c0為吸附液中黃酮質(zhì)量濃度,mg/L;c1為吸附后溶液黃酮質(zhì)量濃度,mg/L;c2為解吸液中黃酮質(zhì)量濃度,mg/L;M為干樹脂的吸附量,mg/L;V為吸附液體積,mg/L[11]。

      1.4 大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸性能優(yōu)化試驗

      1.4.1 大孔樹脂上樣液的泄露曲線測試

      準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂5.00 g進行動態(tài)吸附,取上樣溶液黃酮濃度為2.56 mg/mL,以1 mL/min的流速上樹脂柱。分段收集流出液,每份10 mL,收集30份,以編號為橫坐標(biāo),以黃酮含量為縱指標(biāo),繪制泄漏曲線,流出液中黃酮濃度達到上柱液濃度的10%時,稱為泄漏點,當(dāng)流出液中黃酮濃度達到上柱液濃度的100%時,稱為飽和點[12]。

      1.4.2 上樣質(zhì)量濃度對樹脂吸附的影響

      取7份2.56 mg/mL的TFC提取液,加水稀釋至0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 和 2.00 mg/mL,分別加入D-101樹脂柱,以1.0 mL/min的流速通過,95%乙醇洗脫,測定流出液中黃酮濃度。

      1.4.3 上樣液pH對樹脂吸附的影響

      取6份1.00 mg/mL的TFC 50 mL,分別用酸或堿將 pH 值調(diào)至 4、5、6、7、8、9,分別加入 6 根 D-101樹脂柱,以1.0 mL/min的流速過柱吸附,95%乙醇溶液進行反復(fù)洗脫,測定流出液的黃酮含量。

      1.4.4 大孔樹脂洗脫曲線的測定

      稱取經(jīng)預(yù)處理的D-101大孔樹脂5.00 g,取已知質(zhì)量濃度的黃酮溶液以1 mL/min的流速通過進行動態(tài)吸附,待樹脂達到完全吸附平衡后,用95%的乙醇以以2 mL/min的流速進行洗脫,分段收集洗脫液,每份收集10 mL,分段測定洗脫液中黃酮含量,繪制洗脫曲線[13]。

      1.4.5 大孔樹脂洗脫劑濃度對解吸附的影響

      取5份質(zhì)量濃度0.50 mg/mL TFC提取液各50 mL,分別加入5根D-101樹脂柱,以1.0 mL/min的流速吸附,用55%,65%,75%,85%,95%的乙醇洗脫,測定流出液其中黃酮含量[14]。

      1.4.6 洗脫流速對大孔樹脂解吸附的影響

      取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL黃酮粗提液50 mL,加入D-101樹脂柱,以1.0 mL/min的流速通過后,各用95%乙醇以 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL/min 進行洗脫,測定流出液的黃酮含量。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 大孔樹脂靜態(tài)和動態(tài)解吸附性能測試

      2.1.1 大孔吸附樹脂的篩選

      試驗測定5種性質(zhì)不同的樹脂進行靜態(tài)吸附和解吸附試驗,茼蒿黃酮的吸附量,解吸率和回收率數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

      表1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能Table 1 Static adsorption properties of macroporous resins

      從表1可以看出,TFC吸附量較大的是D-101和AB-8,其次是 DA-201,SD-401 和 DM-301,解吸附率最強的是D-101和AB-8,結(jié)合回收率數(shù)據(jù),D-101樹脂吸附解吸附特性優(yōu)于其他樹脂。

      2.1.2 D-101大孔樹脂泄露曲線測試

      圖1表明,隨著進樣液體積的增加,流出液中黃酮的濃度逐漸增加。當(dāng)上柱體積為60 mL時,流出液中黃酮濃度達到0.256 mg/mL,初始上樣液黃酮濃度的10%,為大孔吸附樹脂D-101的泄露點,所以上柱體積控制在60 mL為宜。當(dāng)上樣液體積逐漸增加,大孔吸附樹脂D-101的吸附量逐漸趨于飽和,當(dāng)樣液達到210 mL時,此時流出液黃酮濃度2.56 mg/mL已和上樣液相近,該體積為大孔吸附樹脂D-101的吸附量的飽和點。

      圖1 D-101樹脂吸附茼蒿黃酮的泄露曲線Fig.1 Leakage curve of TFC on D-101

      2.1.3 上樣濃度對D-101大孔樹脂吸附性能的影響

      圖2所示,在低質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi),隨著進樣濃度的增加,樹脂吸附量和回收率都在增大,在進樣濃度為1.00 mg/mL時,樹脂達到最大吸附量,之后吸附量基本上保持不變,但當(dāng)質(zhì)量濃度大于1.0 mg/mL后,樹脂回收率反而下降,這是因為進樣質(zhì)量濃度大于樹脂的吸附飽和度造成。而且進樣質(zhì)量濃度過高,將導(dǎo)致樹脂再生次數(shù)的增加,縮短樹脂使用周期,所以進樣液初始質(zhì)量濃度1.00 mg/mL為宜。

      圖2 上樣質(zhì)量濃度對D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of concentration on adsorptionof D-101

      2.1.4 上樣pH對D-101大孔樹脂吸附性能的影響

      由圖3可知,TFC吸附量和回收率都隨pH變化明顯,當(dāng)pH值大于6時回收率大于吸附量,當(dāng)pH=6時回收率和吸附量都達到最大值,且隨著pH值繼續(xù)升高兩者都呈下降趨勢,當(dāng)pH≥7時,粗提液會出現(xiàn)沉淀。因此上樣液酸堿度選擇pH=6比較適宜。

      圖3 上樣pH對D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of pH on adsorption of D-101

      2.1.5 D-101大孔樹脂洗脫曲線的測定

      如圖4所示隨著洗脫劑用量的增加洗脫液中TFC濃度在不斷增加,當(dāng)洗脫劑為40 mL時,洗脫液TFC濃度達到極大值,隨著洗脫劑用量的增加,TFC濃度在逐漸降低,洗脫劑為80 mL時,黃酮含量降低至最低值,洗脫液中TFC不足0.01 mg/mL,說明大孔樹脂吸附的TFC基本被洗脫完畢。綜合考慮洗脫峰單一,對稱,尖銳,沒有明顯的拖尾現(xiàn)象,表明95%乙醇80 mL可將TFC完全洗脫下來。

      圖4 D-101大孔樹脂的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of D-101 macroporous resin

      2.1.6 洗脫劑濃度對D-101解吸附性能的影響

      由圖5可得,當(dāng)乙醇體積分數(shù)≤75%時,隨著體積分數(shù)的增加,解吸率和回收率二者逐漸增大,當(dāng)乙醇體積分數(shù)>75%時,二者皆呈下降趨勢。擁有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的黃酮類化合物在水溶液中極性較弱,易被乙醇從樹脂中洗脫。當(dāng)乙醇體積分數(shù)太高時,將大部分雜質(zhì)也一起洗脫。因此確定洗脫劑遺傳的體積分數(shù)75%為宜。

      圖5 洗脫濃度對D-101大孔樹脂解吸附率的影響Fig.5 Effect ofeluent concentration on desorption rate of D-101

      2.1.7 洗脫流速對D-101解吸附性能的影響

      圖6 洗脫流速對D-101大孔樹脂解吸附性能的影響Fig.6 Effect ofelution flow speed on desorption rate of D-101

      如圖6所示,隨著洗脫劑流速的增加,大孔樹脂的解吸率和回收率都在不同程度的下降,特別當(dāng)>3 mL/min時,回收率較解吸率下降快速且明顯。當(dāng)洗脫速率1.0 mL/min時洗脫效果好,而在洗脫速率>3.0 mL/min解吸率下降曲線平緩,而回收率下降明顯從63.25%下降到44.95%。綜合考慮生產(chǎn)周期和回收率確定洗脫速度2.0 mL/min為宜。

      2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化分析

      2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

      依據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗設(shè)計原理,做四因素三水平共29個試驗點(5個中心點)的響應(yīng)面分析試驗。表2中29個試驗點可分為兩類:一類是自變量A、B、C、D取值在各水平所構(gòu)成的三維析因點,共計24個;一類是區(qū)域的中心點,零點試驗重復(fù)5次,用以估計試驗誤差。A(上樣濃度,mg/mL),B(上樣 pH),C(洗脫濃度,%),D(洗脫流速,mL/min)為自變量,TFC回收率為響應(yīng)值Y(指標(biāo)值)[15]。

      表2 響應(yīng)面試驗方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

      2.2.2 響應(yīng)面曲面方差分析

      由表3分析可知,(P=0.047<P=0.05)二次回歸方程模型顯著,失擬項不顯著(P=0.428>P=0.05)。通過該模型的方差分析可知:上樣pH(B)對TFC回收率影響差異顯著(P=0.047),而上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)和洗脫速度(D)3個因素對TFC回收率影響差異不顯著。四因素對TFC回收率影響效應(yīng)的大小依次pH(B)>上樣濃度(A)>洗脫濃度(C)>洗脫速度(D)。經(jīng)回歸模型擬合,四因子對響應(yīng)值Y的影響可用以下多元二次方程:

      Y=63.31-0.72A-0.83B-0.14C-0.072D-0.71AB-0.053AC-0.7AD-0.41BC+0.54BD-0.21CD-2.500E-0.78A2-0.53B2-2.22C2-0.71D2

      表3 響應(yīng)面曲面方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

      2.2.3 兩因素交互影響回收率的響應(yīng)曲面分析

      如圖7所示,回收率的響應(yīng)面開口向下,回收率Y和4個制約因素呈現(xiàn)明顯的二次拋物線關(guān)系。隨著每個因素的增加,響應(yīng)值回收率Y也在增大。根據(jù)吸附動力學(xué)理論,隨著pH(B)、上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)、洗脫速度(D)的增加,響應(yīng)值回收率Y出現(xiàn)極大值,后隨著 A、B、C、D再增加,萃取率 Y呈現(xiàn)不同斜率的下降,該回歸模型具有穩(wěn)定點,穩(wěn)定點是最大值。借助Design-Expert Software 8.0中多元二次回歸模型對TFC萃取率進行估算,對二次拋物線函數(shù)模型進行極值分析,預(yù)測四因素的最佳組合為:上樣濃度0.86 mg/mL,pH=6,洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min此時模型預(yù)測極大值Y=87.3667%(P=0.994)。在Z坐標(biāo)下進行3組重復(fù)試驗,TFC回收率平均高達到85.82%,表明該回歸模型能準(zhǔn)確預(yù)測TFC大孔樹脂吸附性能。

      圖7 兩因素交互影響回收率的響應(yīng)曲面圖分析Fig.7 Response surface analysis of the recovery rate affected by two-factor

      3 結(jié)論

      以茼蒿為原料,對比大孔樹脂分離純化總黃酮的性能,采用單因素和響應(yīng)面試驗相結(jié)合的形式,篩選并優(yōu)化大孔樹脂的純化工藝條件。經(jīng)試驗考察5種不同特性的大孔樹脂中,D-101大孔樹脂對TFC的吸附純化顯示出最佳的性能。D-101大孔樹脂分離純化TFC的泄漏點:上樣體積60 mL,飽和點:210 mL。洗脫曲線表明80 mL的95%乙醇溶液可以將黃酮完全洗脫下來。響應(yīng)面試驗方差分析顯示:上樣pH對TFC回收率影響差異達到顯著水平,而上樣濃度、洗脫濃度和洗脫速度3個因素對TFC回收率影響差異不顯著。通過回歸方程模擬預(yù)測最優(yōu)純化條件組合:上樣濃度0.86 mg/mL,pH=6,洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min,TFC回收率從最初的最高值65.19%提升至87.366%。

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